[发明专利]一种造血嵌合体实时定量PCR检测方法的PCR反应体系

权利要求书

1.一种利用荧光染料SYBR green来进行造血嵌合体的实时定量PCR检测方法的PCR反应体系，所述PCR检测方法包括以下步骤：

S1.收集标本；

S2.选择多态性遗传标记设计引物和探子(probe)；

S3.实时定量PCR检测造血嵌合体；

S4.人工合成12个不同稀释浓度的造血嵌合体；以及

S5.统计学分析；

其中，所述步骤S3实时定量PCR检测造血嵌合体的中，利用SYBRgreen和TaqMan的定量PCR，每个反应20微升，在Rotor gene3000荧光定量PCR仪中进行，所述PCR反应体系如下：样本DNA100ng，Sybr Green Mastermix 10μl，引物0.1μM，加MilliQ超纯水至终体积为20μl。

2.如权利要求1所述的造血嵌合体的实时定量PCR检测方法的PCR反应体系，其中，在定量之前，先筛选适用于供体和受体的多态性标记。

3.如权利要求1所述的造血嵌合体的实时定量PCR检测方法的PCR反应体系，其中，筛选多态性标记的步骤如下：

以供体和受体移植前的DNA为底物，从12个多态性遗传标记中选择出一个最适合的等位基因位点；其中阳性等位基因定义为Ct值在20～25之间，阴性等位基因定义为Ct值＞36；

当供体和受体显示出不同的PCR产物时，说明供体和受体具有不同的等位基因，这个标记可以用来作为定量检测造血嵌合体的多态性标记。

4.如权利要求1所述的造血嵌合体的实时定量PCR检测方法的PCR反应体系，其中，PCR条件如下：50℃下反应2分钟；95℃下反应10分钟；以及在95℃反应15秒，60℃反应60秒进行40个反应周期。

5.如权利要求1所述的造血嵌合体的实时定量PCR检测方法的PCR反应体系，其中，在步骤S3中还包括运行熔解曲线来验证PCR产物的特异性。