[发明专利]一种人源抗鼻咽癌LMP1胞外区抗体及其应用

说明书

技术领域：

本发明属于基因工程领域和免疫靶向诊疗领域，涉及一种人源抗鼻咽癌LMP1胞外区抗体及其应用。

背景技术：

鼻咽癌是来源于鼻咽上皮的高度恶性肿瘤，肿瘤进展极易侵犯颅底等重要结构，并较早发生颈部淋巴结转移和远处转移。鼻咽癌表现为种族和地区分布的特点，是我国十大高发恶性肿瘤之一，其发病率为20/100,000，已引发严重健康问题。鼻咽癌是由Epstein-Barr病毒(EBV)的潜伏感染、环境因素和宿主的基因遗传因素共同参与的多步骤交互作用而逐步形成的复杂性疾病。所有的鼻咽癌细胞都含有EBV基因组，并表达EBNA1，EBER1，EBER2，和LMP1，LMP2A，LMP2B，这使得这些病毒蛋白成为理想的肿瘤标志物，其中LMP1(latent membrane protein1，LMP1)在鼻咽上皮细胞的转化和癌变过程中的作用倍受关注，是目前公认的病毒癌基因。它以其独特的蛋白分子结构参与鼻咽癌发生和发展的全过程。

目前还没有一种能够具有靶向作用的人源抗鼻咽癌LMP1胞外区抗体。

发明内容

本发明目的是提供一种人源抗鼻咽癌LMP1胞外区抗体。

本发明另一个目的是提供上述抗体在制备靶向作用于人类鼻咽癌LMP1胞外区的药物中的应用。

本发明还有一个目的是提供能够靶向作用于人类鼻咽癌LMP1胞外区的药物。

发明人通过建立潜伏膜蛋白1(LMP1)胞外区-GST融合蛋白作为抗原，以噬菌体抗体展示技术，利用细胞与抗原固相筛选相结合的方法进行筛选人源噬菌体抗体库(Fab抗体库)。多轮筛选后经噬菌体酶联免疫吸附反应(phage enzyme linked immunosorbent assay，phage ELISA)进行阳性克隆鉴定。筛选出人源抗LMP1胞外区抗体Fab(命名为HLEAFab)。原核表达HLEAFab抗体，表达蛋白产物使用Protein L亲和层析柱纯化；纯化产物经ELISA、流式细胞技术以及免疫荧光技术进行鉴定。进一步通过体外实验显示该抗体与鼻咽癌细胞HNE2-LMP1胞外区特异性结合特性和靶向功能。在此基础上，靶向鼻咽癌细胞LMP1胞外区人源抗体Fab结合丝裂霉素C制备免疫毒素HLEAFab-丝裂霉素C(HLEAFab-MMC)。MTT法检测HLEAFab-MMC对人鼻咽癌细胞系HNE2-LMP1生长的抑制作用；流式细胞术检测HLEAFab-MMC对鼻咽癌细胞HNE2-LMP1细胞凋亡和细胞周期的影响。观察靶向鼻咽癌细胞LMP1胞外区人源抗体Fab-MMC免疫毒素体内抑瘤效应。

本发明的目的是通过下列措施实现的：

一种人源抗鼻咽癌LMP1胞外区抗体，该抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的抗体，其中编码其轻链可变区氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码其重链可变区氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述抗体的表达载体，该表达载体为质粒、噬菌粒或噬菌体。

所述的抗体在制备靶向作用于人类鼻咽癌LMP1胞外区的药物中的应用

一种药物组合物，含有上述抗体和抗鼻咽癌药物。

所述的药物组合物，其中上述抗体与抗鼻咽癌药物化学偶联。

所述的药物组合物，其中抗鼻咽癌药物为丝裂霉素。

本发明有益效果：

本发明利用基因重组技术，以噬菌体抗体展示技术筛选人源抗LMP1胞外区抗体Fab，并制备靶向作用于鼻咽癌的免疫毒素HLEAFab-丝裂霉素C(HLEAFab-MMC)，为鼻咽癌治疗提供了更多的药物选择。

附图说明

图1.LMP1胞外区融合基因在大肠杆菌系统中的表达。其中：M：蛋白标准分子质量；1：pGEX-4T-2载体诱导纯化后的GST蛋白；2：pGEX-LED1诱导后的重组菌；3：诱导前的重组菌；4：非重组菌BL21(DE3)。

图2.噬菌体抗体库筛选的ELISA检测结果。

图3.抗LMP1胞外区抗体Fab表达的western blot结果。其中：1.Top10空菌；2.HLEAFab克隆超声上清；3.HLEAFab克隆超声沉淀；4.HLEAFab。

图4.纯化的抗LMP1胞外区抗体Fab(HLEAFab)SDS-PAGE结果(纯化的36号阳性克隆表达产物)。

图5.纯化的HLEAFab与细胞株HNE2-LMP1的结合的细胞ELISA测定结果。