[发明专利]霍乱弧菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于致病微生物检测技术领域，具体涉及一种霍乱弧菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒。

背景技术

霍乱弧菌(vbrio cholera)是霍乱(cholera)的病原菌。霍乱，又称为亚细亚霍乱或传染性霍乱，是由O1血清群和O139血清型霍乱弧菌引起的一种烈性、猝发性的急性细菌性传染病，其危害性仅次于鼠疫。它可引起流行、爆发和大流行。临床特征为剧烈腹泻、呕吐、大量米泔样排泄物、水电解质紊乱和周围循环衰竭，严重休克者可并发急性肾功能衰竭。由于霍乱流行迅速，且在流行期间发病率及死亡率均高，危害极大，因此早期迅速和正确的诊断，对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。在我国，霍乱主要发生在夏秋季节，高峰期在7-8月间。2004年年末印度洋大地震和海啸中遇难人数突破15万，重灾区最先出现的疫情就有霍乱。

霍乱弧菌现有的检测方法主要有常规分离鉴定法、普通PCR检测法、荧光定量PCR检测法、胶体金免疫层析试验法等。目前尚未见用切刻内切酶核酸恒温扩增技术检测上述菌株的试剂盒及其检测方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种霍乱弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒，以克服现有技术的不足，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。

本发明的主要原理如下：

(1)设计一对5′端带切刻内切酶识别序列的引物和一对分别由生物素和FITC标记的探针；

(2)把引物和目标菌的模板DNA加入到模板预处理反应液，在Taq Platinum DNA聚合酶作用下，通过几个预变性和扩增的循环过程，把切刻内切酶识别序列引入到待扩增序列中，作为NEMA恒温扩增的模板；

(3)切刻内切酶识别NEMA模板上的识别序列，在其中一条核酸链上切割形成切口，暴露其3′端；

(4)在具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的作用下，以暴露的3′端为起点，以未被切断的另一条核酸链为模板，合成新的双链核酸，旧链被剥离下来成为下一轮核酸合成的模板，同时在新合成的双链核酸上恢复切刻内切酶识别位点；

(5)切割、延伸和剥离的步骤重复进行，扩增出大量靶核酸序列；

(6)扩增产物利用通用型核酸扩增物快速检测板检测；

核酸扩增完成后，在反应管中加入探针与扩增产物杂交。把检测板水平放置在操作台上，取杂交产物10μL加入检测板的样品孔中，再加入100μL缓冲液进行层析，10min左右判读结果。

通用型核酸扩增物快速检测板(杭州优思达生物技术有限公司批号20101026-2)的上C为质控区，T为检测区。检测板在质控区C和检测区T均出现红色条带，为阳性结果，表明样本中含有检测的目标物；仅在质控区C出现红色条带，为阴性结果，表明样本中为检出目标物；质控区C和检测区T内均无红色条带出现，表明快速检测板失效。

本发明的一个方面涉及用于恒温扩增快速检测霍乱弧菌的引物及探针，其中正向引物序列为SEQ ID NO：1：

5-TGATTATATGCTCAGCTCTTCCTGGTTCCTCAACGCTTCTGT-3；

反向引物序列为SEQ ID NO：2：

5-GATTTCATTATCCGGCTCTTCGGCATCTGCACCTGCTTTGTA-3。

其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；

P1探针的序列为SEQ ID NO：3：

P1：5-TGGTTCCTCAACGCTTCTGTGTGGTAT-3      5端标记生物素；

P2探针的序列为SEQ ID NO：4：

P2：5-CAACGGCAACCTACAAAGCAGGTGC-3        3端标记FITC。

本发明的另一个方面涉及一种霍乱弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒，包括如下的组分：

(1)模板预处理反应液：

每23μL包括10×Taq Platinum buffer II反应缓冲液，0.1～1.0mmol/L dNTP，0.1～1.0μmol/L正向引物，0.1～1.0μmol/L反向引物，Taq Platinum DNAPolymerase 2.5U；