[发明专利]一种基因工程口服DNA疫苗及制备方法和应用

权利要求书

1.一种基因工程DNA疫苗，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种基因工程DNA疫苗，其序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.一种基因工程DNA疫苗，其特征在于：该疫苗为重组基因工程菌株Salmonellatyphimurium W0420/pcDNA3.1(-)--signal-GH，CCTCC NO：M2011233。

4.一种用于权利要求3所述的基因工程DNA疫苗的制备方法，包括下列步骤：

A、鲤鱼生长激素成熟肽基因的制备：

用鲤鱼脑垂体，按照RNA提取试剂盒的方法提取其总mRNA后，通过RT-PCR得到总cDNA，根据GenBank鲤鱼生长激素的cDNA序列，设计并合成引物，以得到的总cDNA为模板，PCR扩增得到鲤鱼生长激素GH基因，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体中，转化到大肠杆菌JM109，挑取单菌落培养，用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含gh基因的大肠杆菌，命名为pGEM-T-GH；

B、融合基因sgh的制备：

PCR扩增sgh基因：通过PCR重叠延伸技术分3次PCR合成sgh，以pGEM-T-GH质粒为模板，上游引物P1：5_TTCGCCCTGGTCTGCCAAGGCATGGGGTCAGACAAC3_，下游引物P4：5_GCGCTCGAGCTACAGGGTGCAGTTGGAATCCAGGGATCT3_划线处为XhoI位点，退火温度为56℃，PCR扩增目的片段，电泳并作回收；以上一步回收产物为模板，以上游引物P2：5_GTCTGCCTGGTCTTCTTGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTG3_，下游引物P4：5_GCGCTCGAGCTACAGGGTGCAGTTGGAATCCAGGGATCT3_，退火温度56℃做PCR，电泳并作回收；以上一步回收产物为模板，以上游引物P3：5_GCGGCTAGCATGGGGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTC3_，下游引物P4：5_GGCCTCGAGCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA3_，退火温度56℃做PCR，PCR扩增目的基因sgh，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体中，转化到大肠杆菌JM109，挑取单菌落培养，用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含sgh基因的大肠杆菌，为pGEM-T-SGH；

C、融合基因真核表达载体的构建：

用限制性内切酶NheI，XhoI双酶切pGEM-T-SGH和pcDNA3.1(-)，胶回收开环质粒pcDNA3.1(-)和SGH基因的片段，4℃连接后转化到感受态JM109中，所得到的阳性克隆子为JM109/pcDNA3.1(-)--signal-GH；

D、质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌：

将质粒pcDNA3.1(-)--signal-GH(5μl)转化减毒鼠伤寒沙门氏菌Salmonellatyphimurium W0420感受态细胞中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得口服DNA疫苗。

5.权利要求3所述的一种口服DNA疫苗基因工程菌株在克氏螯虾幼虾养殖业中的应用。