[发明专利]一种缨小蜂体内共生沃尔巴克氏细菌的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及昆虫体内共生菌的分子检测，具体涉及缨小蜂体内共生菌沃尔巴克氏（Wolbachia）细菌的检测方法。

背景技术

缨小蜂隶属膜翅目缨小蜂科(Mymanidae)，是水稻主要害虫飞虱卵期一种重要的寄生蜂。缨小蜂群体数量大、效能高，对早稻田发生的灰飞虱、白背飞虱和晚稻田后发的褐飞虱起显著的抑制作用。因此，对缨小蜂的研究在水稻病虫害生物防治中具有重要意义。现有的研究已经表明，寄生蜂体内存在着大量的共生微生物，其中沃尔巴克氏（Wolbachia）细菌分布最广，它能诱导寄生蜂产雌孤雌生殖和细胞质不亲和，引起寄主的生殖行为异常，使寄主后代性比失衡。此外，沃尔巴克氏（Wolbachia）细菌还影响寄生蜂行走和扩散能力、寄生率和羽化率、寿命、竞争力和滞育等。对寄生蜂体内共生菌的研究有助于研究人员深入探索寄生蜂和寄主昆虫之间的协同进化关系、攻克寄主防御系统以及调控寄主生长发育并正确理解寄生蜂成功进化的生态策略。同时，对提高寄生蜂的人工繁育效率、控制农林重大害虫的发生与危害的潜能均具有重要的理论和实践意义。

昆虫体内沃尔巴克氏（Wolbachia）细菌的检测是最为基础性的工作，到目前为止，沃尔巴克氏细菌（Wolbachia）尚无法在寄主体外进行培养，所以很难用传统微生学的方法对沃尔巴克氏（Wolbachia）细菌进行检测和研究，沃尔巴克氏（Wolbachia）细菌的检测主要依赖基于聚合酶链式反应（PCR）的分子生物学技术方法。

当前常用于研究沃尔巴克氏（Wolbachia）细菌的分子标记主要是位于核糖体RNA基因编码区（16S rDNA、23S rDNA、5S rDNA）、核糖体RNA基因非编码区（16S和23SrRNA编码基因间的间隔区—ITS-1和位于23S和5SrRNA编码基因间的间隔区—ITS-2）的序列，以及编码蛋白的基因序列，如Wsp基因、ftsZ基因等。洪晓月等人公开的中国发明专利：检测叶螨体内共生菌的多重PCR检测方法（申请号：2009 1 0032015.5，公开号：CN 101603081 A）中公开了基于Wsp基因的昆虫体内共生菌沃尔巴克氏（Wolbachia）细菌的检测方法。上述现有技术的共同特点在于它们均包含两个关键步骤：提取昆虫的总DNA，然后采用适合的分子标记进行PCR扩增，随后可以根据电泳检测的结果或者测序分析的结果来判断昆虫体内是否存在共生菌沃尔巴克氏（Wolbachia）细菌，以及其种类。

现有技术的缺陷在于：影响PCR的因素，如提取的DNA模板质量、用于PCR的引物和试剂、PCR反应体系、PCR反应条件、所用引物对样品DNA中目标基因的扩增效率等均可能影响到最终的检测结果，现有技术无法在实验体系中确保检测结果不受上述因素的影响，尤其是在得出阴性的检测结果时。因此，建立一种相对严谨的基于PCR的对昆虫体内沃尔巴克氏（Wolbachia）细菌检测的实验体系，是当前研究中需要解决的重要问题。此外，快速、准确的确定昆虫体内沃尔巴克氏（Wolbachia）细菌的种类也是需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足，建立一种相对严谨的基于PCR的检测缨小蜂体内沃尔巴克氏（Wolbachia）细菌的实验体系，同时，该检测方法的结果同时可以快速、准确的确定昆虫体内沃尔巴克氏（Wolbachia）细菌的种类。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

以提取获得的缨小蜂总DNA为模板，采用巢式PCR与DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)，即变性梯度凝胶电泳，技术结合的方式进行共生菌沃尔巴克氏（Wolbachia）细菌的检测，具体技术路线图如附图1所示。