[发明专利]鸭疫里默氏杆菌特异性PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种家禽常见疾病领域检测方法，尤其是鸭疫里默氏杆菌特异性PCR检测方法。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)是鸭传染性浆膜炎的病原菌，该病是危害水禽养殖业，特别是养鸭业重要的疫病之一。家禽中以鸭最易感染，其中樱桃谷鸭、番鸭、麻鸭、丽佳鸭等多品种的鸭均可发病。本病呈急性或慢性败血症过程，以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎以及部分干酪样输卵管炎、关节炎为特征。发病率为10％-90％，病死率高达80％，一年四季均可发生。世界各养鸭地区几乎都有该病流行，是危害养鸭业最严重的疾病之一，给养鸭业造成了巨大的经济损失。传统鉴定RA通常检测其培养特性、形态染色、生理生化特征、菌体的某些化学组成等表型指标，但用表型指标鉴定鸭疫里默氏杆菌存在不足。另外，传统的鉴定方法操作复杂，费时费力，不利于及时诊断病因、查病原和控制病情的蔓延。针对鸭疫里默氏杆菌这些特点，许多研究学者建立了一些检测技术，如荧光抗体技术、ELLSA、免疫组化等相继报道，但在实践中都有不同程度的局限性。为了能快速、准确、简便的检测鸭疫里默氏杆菌，以分子生物学为基础的检测鉴定方法在实践检验中不断的取得新进展，是取代传统检测方法最具潜力的检测方法之一，其中，PCR以其敏感、特异、简便、快速的特点成为分子生物学水平的重要检测技术之一。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种鸭疫里默氏杆菌PCR检测方法。采用本发明的检测方法检测鸭疫里默氏杆菌，检测时间短，成本低，更加具有实用性，检测结果特异，结果判断简单。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

一种鸭疫里默氏杆菌PCR检测方法，包括如下步骤：

步骤一，根据鸭疫里默氏杆菌的基因组DNA序列中gyrB基因的保守序列SEQ ID NO：1设计扩增引物；所述引物为：正向引物序列如SEQ ID NO：2所示；反向引物如SEQ ID NO：3所示；

步骤二，提取样品DNA，PCR法扩增；PCR检测体系具体为：25μL反应体系具体为，10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L的Mg 2.0μL，2.5mmol/L的dNTP 1.0μL，Taq酶0.25-1U，5μM引物对1μL，模板2-5μL，最后用双蒸水补至25μL；PCR检测反应程序：先95℃预变性5min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；30个循环结束后，72℃延伸10min，降温至12℃，结束；

步骤三，凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有鸭疫里默氏杆菌；所述判断具体为：如果电泳结果出现相应的单一扩增条带，则说明样品中含有鸭疫里默氏杆菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有鸭疫里默氏杆菌。

所述的鸭疫里默氏杆菌PCR检测方法，步骤三中，所述判断的具体方法为：检测凝胶电泳检测扩增产物在194bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，则说明样品中含有鸭疫里默氏杆菌；如果没有出现相应的单一条带，则样品中不含有鸭疫里默氏杆菌。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：采用本发明的检测方法检测鸭疫里默氏杆菌，检测时间短，准确，快速。避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、检出率底、假阳性较多等缺点。同时不用采用传统方法中必须使用的抗血清，降低了检测成本。本发明的检测靶点具有单一特异性，检测结果特异，结果判定简单。

附图说明

图1为实施例2中PCR检测方法特异性评估实验凝胶电泳结果图；

图2为实施例3中PCR检测方法灵敏评价实验凝胶电泳结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

鸭疫里默氏杆菌PCR方法的建立

通过生物信息学分析，从鸭疫里默氏杆菌基因组DNA序列中找到特异DNA转录、复制、重组及修复过程中发挥重要作用的gyrB基因，将之作为鸭疫里默氏杆菌检测靶基因，基因序列如SEQ ID NO：1所示；