[发明专利]克林霉素的杂质分析制备方法

权利要求书

1.克林霉素原料的杂质分析制备方法，该方法用于对克林霉素原料进行分析，并从中分离制备所述杂质，包括下列步骤：

a)用LC-MS法测定所述克林霉素原料，根据被分析成分的相对保留时间和/或分子量确定所述原料中的一种或多种杂质；

b)根据步骤a)中所述的一种或多种杂质的相对保留时间和/或分子量确定柱层析法的条件，使用正相硅胶柱层析法富集该相对保留时间和/或分子量对应的一种或多种杂质；

c)根据步骤a)中所述的一种或多种杂质的相对保留时间所显示的色谱保留行为确定制备色谱法的条件，用制备色谱法收集所述保留时间相对应的一种或多种杂质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述的LC-MS法测定所采用HPLC条件为：

流动相18％乙腈、3％四氢呋喃、79％水和0.2％甲酸；

pH氨水调至5.43-5.47；

柱温25℃；

流速1.0ml/min；

检测波长210nm；

色谱柱Diamonsil ODS C18，5μm，250×4.6mm柱。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)中，所述的正相硅胶柱层析法富集采用的固定相为100～200目硅胶，流动相为乙酸乙酯和水饱和甲醇混合溶剂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)包括：

b 1)样品∶硅胶＝1∶50，将样品溶于甲醇中，干法上柱；

b2)使用乙酸乙酯∶甲醇混合溶剂梯度洗脱，洗脱顺序如下：(乙酸乙酯∶甲醇9∶1)1800mL，(乙酸乙酯∶甲醇6∶1)1680mL，(乙酸乙酯∶甲醇5∶1)600mL，(乙酸乙酯∶甲醇4∶1)600mL，(乙酸乙酯∶甲醇3∶1)600mL，(乙酸乙酯∶甲醇2∶1)600mL，(乙酸乙酯∶甲醇1∶1)600mL，甲醇600mL；

b3)合并收集(乙酸乙酯∶甲醇9∶1)、(乙酸乙酯∶甲醇6∶1)和(乙酸乙酯∶甲醇5∶1)-甲醇的洗脱液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c)中，所述的制备色谱法采用二次制备，其中一次制备所采用条件包括：

流动相为20％乙腈，1.25％四氢呋喃，78.75％水，0.2％甲酸；

氨水调pH为5.58左右；

色谱柱μBondapak^TM C18，7.8×300mm，检测波长为210nm，流速为1.0×2.25mL/min；

收集保留时间为29.525min处的峰相对应的被分析物；

对所得被分析物进行采用二元泵的二次制备，流动相的条件为：A泵：21％乙腈，3％四氢呋喃，76％水，0.2％甲酸，pH为5.20左右；B泵：乙腈；A∶B＝95∶5；色谱柱Sepax HP-C18，5μm 10.0×250mm，检测波长：210nm，流速：1.5mL/min，柱温：35℃；收集保留时间为25.90min和27.68min处的峰相对应的被分析物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c)中，所述的制备色谱法所采用条件包括：

流动相：18％乙腈，4.5％四氢呋喃，77.5％水，0.2％甲酸；

氨水调pH值为5.45左右；

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，9.4×250mm)；检测波长：210nm；流速：1.0×2.25mL/min；

收集保留时间为41.080处的峰相对应的被分析物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对所得被分析物进行纯化，条件如下：仪器：HP 1100，配有Waters 2695 Separation Module，Waters 2487 DualλAbsorbance Detector Waters；检测波长：210nm；流速：1.5mL/min；柱温：35℃；流动相：25％乙腈，3％四氢呋喃，72％水，0.2％甲酸，氨水调pH为5.19左右。

8.根据权利要求1-5中任一项所述方法制备的杂质标准品，其特征在于，所述杂质具有如下结构式I：

9.根据权利要求1-5中任一项所述方法制备的杂质标准品，其特征在于，所述杂质具有如下结构式II：