[发明专利]小麦中几种真菌毒素含量的检测方法

说明书

技术领域

本发明属分析化学领域，具体涉及对小麦中多种毒素的检测方法，尤其是同时对小麦中DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN、T-2毒素的检测方法。

背景技术

    小麦赤霉病是我国小麦产区重要的植物病害，不仅导致严重的产量损失，而且由于致病菌禾谷镰刀菌在谷物中产生许多真菌毒素，严重影响人畜健康。这类毒素主要包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、3Ac-DON、15Ac-DON、T-2以及玉米赤霉烯酮（ZEN）等。我国赤霉病的控制研究历经数十年，尽管在农药控制以及抗病育种方面都取得了重要成果，但是仍没有达到理想的控制效果，尤其在我国小麦主产区黄淮流域，小麦品种绝大部分对赤霉病表现敏感，病害流行威胁严重。最近十年，基于对镰刀菌单端孢霉烯族毒素代谢分子机理的解析，一些重要解毒素基因的转基因育种开始兴起，尤其在美国加拿大地区已取得重大进展。

    镰刀菌单端孢霉烯族毒素的生物合成代谢中，Tri101可以催化C-3羟基的乙酰化，减轻合成产物的毒性，以保护镰刀菌本身不被毒素抑制。研究表明，C-3羟基的乙酰化可以降低最终合成的毒素如DON和T-2毒性的100倍。而镰刀菌毒素生物合成途径中的最后一步，就是清除被保护的C-3结构，随即将具有毒性的毒素释放到菌体外。

国内外许多实验室已经从Fusarium  sporotrichoides，Fusarium graminearum 中分离到的Tri101基因，并插入到小麦、水稻、烟草等植物中，表现出较好的毒素抗性。由于Tri101来自于产毒素镰刀菌，且毒素合成代谢复杂，转Tri101基因小麦是否会成为毒素产生的主体，或者病原菌在毒素合成主途径被控制后，是否会出现代谢旁路，甚至产生其他有毒物质？鉴于对这些因素的考虑，有必要对小麦中的各种不同毒素的产生及代谢情况进行系统的检测和排查，以确保小麦食用安全性，而建立这样的检测方法也显得尤为重要。

目前的检测方法大多是针对样品中单一毒素的特性，采用免疫亲和柱的方法纯化样品，获得针对单一毒素的提取液，所以对于同一个样品中的多种毒素要进行多次不同方法的提取和不同的液相色谱检测才能获得同一样品中不同毒素的含量。

发明内容

本发明的目的在于：针对小麦中毒素产生过程中合成途径的改变，研究快速检测小麦中多种真菌毒素的定量检测方法，以确保小麦中相关毒素的含量在限定范围之内，为小麦的食用安全提供有效的保障。

本发明的目的是这样实现的：一种对小麦中几种真菌毒素含量的检测方法，是利用高效液相色谱串联质谱的方法检测小麦中的真菌毒素，其特征在于：检测中涉及的几种真菌毒素为镰刀菌属的脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON、3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇3-Ac-DON、15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇15-Ac-DON、玉米赤霉烯酮ZEN和T-2毒素，采用的毒素标准液为含有DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN、T-2毒素的混合毒素标准液，具体检测方法是：

a) 将小麦样品用高速万能粉碎机磨细并通过1mm孔径试验筛，称取10.00 g麦粉置于250 mL三角瓶中，加入50.0 mL的提取液，室温摇床200 r/min 振荡30分钟, 于室温6000 r/min离心5分钟，收集上清，得到粗提液；

b) 将氨基柱用3 mL的提取液进行预平衡，当溶剂液面到达氨基柱吸附层表面时，立即准确移入5.0 mL粗提液，用离心管收集过氨基柱的提取滤液，再用2 ml的提取液（乙腈+水，体积比为80：20）洗脱，收集洗脱的滤液，把提取滤液和洗脱的滤液合并，置于氮吹仪上，水浴温度50℃吹干，然后加入洗脱液，定容至5.0 mL，得到净化后的毒素提取液；

c) 混合毒素标准液的配制：把DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN、T-2毒素的标准品用洗脱液配置成7种毒素含量不同的混合毒素标准液，每个混合毒素标准液中的DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、ZEN毒素浓度相同，由高到低依次为1000 ng/ml、500 ng/ml、200 ng/ml、100 ng/ml、50 ng/ml、20 ng/ml和10 ng/ml， T-2毒素的浓度依次为50 ng/ml、25 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、2.5 ng/ml、1.0 ng/ml和0.5 ng/ml；

d) 采用高效液相色谱串联质谱的方法检测毒素提取液中各种不同的真菌毒素；