[发明专利]一种3-羟基丙酸高产菌株及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种3-羟基丙酸高产菌株及其应用，尤其是一种是经物理化学复合诱变得到的酵母菌Candida sp.及其应用于转化丙酸为3-羟基丙酸。

背景技术：

3-羟基丙酸(3-Hydroxypropionic acid；又称β-Hydroxypropionic acid；缩写为3-HP；分子式C₃H₆O₃；CAS号503-66-2；pK4.51；分子量90；密度1.08)是一个三碳无手性有机酸，与乳酸互为同分异构体。3-HP具有羟基和羧基两个官能团，是很多光学活性物质的前体。它脱水可以生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，还原生成1，3-丙二醇，聚合生成高分子材料，是一种重要的化工平台产品。2004年美国能源部将其列为当今世界12种最具潜力的化工产品之一。

目前，3-HP的生产方法是化学合成法，主要有水合丙烯酸法和β-丙烯腈转化法。但在碳末端引入功能团有很大的难度，且其产品不易分离提纯，生产成本较高，生产过程存在不安全因素，而微生物发酵方法生产3-HP可以有效的避免这些不利因素。微生物转化法生产3-HP的研究始于上世纪60年代但一直处于实验室阶段。主要包括构建基因工程菌法和野生菌发酵法。基因工程法生产3-HP主要有两条途径：以葡萄糖为底物和以甘油为底物的生物转化路线。目前，已知的可发酵产3-HP的野生菌株主要有：Hansenula miso；Fusarium merismoides；Candida rugosa；Byssochlamys sp.；Rhodococcus erythropolis LG12；Klebsiella terrigena。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是提供一种3-羟基丙酸高产菌株，为假丝酵母变种(Candida sp.)，通过紫外-亚硝基胍-钴60复合诱变获得，于2011年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏委员会管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5344，其催化丙酸转化为3-羟基丙酸的能力增强，同时，耐受丙酸的性能增强。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种应用所述菌株转化丙酸为3-羟基丙酸的方法，菌株经过种子培养活化后，以4-10％接种量接种发酵培养基，在28-32℃下发酵培养96h得到含有3-羟基丙酸的发酵液。

为提高3-羟基丙酸的产率，控制发酵培养基pH为6.5，不限于在发酵培养基中加入浓度为10-30％(V/V)，pH为6.5的磷酸盐缓冲液；优选20％(V/V)的磷酸盐缓冲液(6.5)。

为了进一步提高3-羟基丙酸的产率，对发酵过程进行优化，发酵24小时后，流加含有葡萄糖/甘油的缓冲液或葡萄糖/甘油水溶液控制发酵过程中葡萄糖浓度在15-25g/L；其中优选的添加为发酵48-84h内补加含有葡萄糖/甘油的缓冲液或葡萄糖/甘油水溶液以维持发酵过程中葡萄糖浓度在20g/L。

此外，发酵24小时后，流加丙酸-氢氧化钠-氢氧化钾-氢氧化铵(8∶1∶1∶1)或丙酸溶液控制发酵过程中丙酸浓度为10-20g/L；其中优选的添加为在发酵48h后，流加丙酸-氢氧化钠-氢氧化钾-氢氧化铵(8∶1∶1∶1)或丙酸溶液以维持发酵过程中丙酸浓度为15g/L。

3-羟基丙酸的测定方法：高效液相色谱法，色谱柱：Ecosile C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：3％甲醇，用H₃PO₄调pH至2.0；检测条件：紫外检测器，柱温35℃，流速0.8mL/min，进样量20μL。

本发明提供的3-羟基丙酸产量较高的突变菌株，其产量高且遗传性状稳定。此外，本发明还提供了一种该菌株以丙酸为底物生物转化3-羟基丙酸的方法，利用此方法3-羟基丙酸的产量达到23g/L，具有广阔的前景。

具体实施方式：

实施例1新菌株CGMCC No.5344的获得

(a)将野生菌Candida sp.CCTCC NO：M 93018用含有丙酸的培养基驯化，挑选得到的出发菌株a；

(b)将出发菌株a经紫外-亚硝基胍-钴60复合诱变，得到混合种子液b；

(c)将b涂布完全培养，得到单菌落点种筛选培养基；

(d)培养筛选单菌落，发酵检测验证，得到诱变高产株CGMCC No.5344。

步骤(a)中丙酸驯化的浓度为0.5％-3％。