[发明专利]鸡传染性贫血病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及鸡传染性贫血病毒的生物学鉴定方法，特别涉及对鸡传染性贫血病毒特定基因片段具有特异性的引物组，还涉及将所述引物组用环介导等温扩增法快速检测鸡传染性贫血病毒的试剂盒。

背景技术

鸡传染性贫血病毒( Chicken anemia virus，CAV) 是鸡传染性贫血病( Chicken infectious anemia，CIA) 的病原。CAV 感染可引起雏鸡骨髓造血组织和胸腺等淋巴组织萎缩, 从而导致严重贫血和免疫抑制，引起继发感染和疫苗免疫失败。我国于1992 年首次在黑龙江省分离到CAV，目前该病在我国流行范围不断扩大、感染率增高的趋势。

鸡贫血病毒是目前已知最小的动物病毒之一, 为单股环状DNA, 基因组长度为2.3 kb。CAV基因组单链有3个部分或完全重叠的开放阅读框( ORF)，分别编码核衣壳蛋白VP1、相关蛋白VP2、细胞凋亡因子VP3 3 种蛋白。至今发现的所有CAV 毒株的抗原性都相同, 均属于同一个血清型。

环介导等温扩增法(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi 等于2000 年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶序列的6 个特异性区域设计两对引物，利用一种具有链置换活性的DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase) 在等温条件下(65 ℃左右) 保温30～60 min ，即可实现核酸的大量扩增，并且伴有肉眼可见的副产物白色焦磷酸酶沉淀产生。此外，还可以向产物中加入DNA荧光染料的方法进行判定。该项技术已广泛应用于病毒、细菌、寄生虫等病原检测和胚胎性别的鉴定。

对CAV的诊断有血清学和分子生物学等多种方法，其中LAMP法具有特异性高、操作简便、不需特殊设备等优点在临诊应用上优势明显。目前，已公开的与本专利相关的针对CAV检测的LAMP引物组如：“一种快速检测鸡传染性贫血病毒的方法及试剂盒”（专利申请号为200810223382.9），其引物组位于CAV基因序列的491bp～732bp位点之间。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鸡传染性贫血病毒的检测方法，要求具有特异性高、操作简便、不需特殊设备，在兽医临床诊断或检疫中应用强的特点。

为解决上述技术问题，本发明公开一种通过环介导的核酸等温扩增技术快速检测鸡传染性贫血病毒基因的特异性引物组，并提供利用上述引物组快速、高效、特异性地检测鸡传染性贫血病毒的方法，以及利用上述方法制备的快速检测试剂盒。

本发明的上述内容是通过以下方案实现：

一、本发明的鸡传染性贫血病毒基因检测用引物组，是基于基于环介导的核酸等温扩增技术，根据Genebank上已公开的鸡传染性贫血病毒基因组序列，经比对后选取高度同源的基因组序列，以65个国内外CAV毒株100％同源的基因序列532bp～729bp位的198个核苷酸序列为靶区域，设计特异性LAMP引物组，通过LAMP法特异性扩增来鉴定鸡传染性贫血病毒基因。

所述65个国内外CAV毒株Genebank登录号如附录表2所示。

所述特异性LAMP引物组包括以下6条引物：

正向外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；

反向外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；

正向内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示；

反向内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示；

正向环引物LF，其核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示；

反向环引物LB，其核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。

二、本发明的鸡传染性贫血病毒快速检测方法，是采用上述引物组对待测样品的DNA进行环等温扩增，反应体系与条件为范围值内的变量；反应产物是通过产物琼脂糖凝胶电泳，阳性反应呈现梯状带；或加入Mg²⁺，检测副产物焦磷酸镁沉淀物的浊度；或加入显色剂，根据颜色变化来判断反应结果。

具体检测方法为：

（1）样品处理和模板提取，样品范围适用于组织病料、细胞培养上清、血清等病毒待检样品。取适量样品（可适量加入碱液稀释，使pH 8.3～9.3）煮沸裂解后，离心取上清作为LAMP模板。

（2）鸡传染性贫血病毒的环介导等温扩增