[发明专利]一种尿液中多胺类物质的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种尿液中多胺类物质的测定方法，更确切地说是一种对尿液中多胺类物质进行高效灵敏定量测定的方法。 

背景技术

多胺是一类小分子脂肪胺类化合物，带有两个或两个以上伯胺基与仲胺基，通常指1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺及其酰化产物等。多胺在生物体内广泛存在，参与基因表达和翻译的调节、细胞增殖等生命活动过程，与癌症的发生发展密切相关。 

目前对体内内源性物质多胺的定量测定主要有液相色谱-荧光衍生化法、液相色谱-紫外衍生化法、免疫法和液相色谱-质谱检测法几种。液相色谱-荧光衍生化法具有灵敏的特点，但其它内源性物质易干扰其测定，专一性较差难以满足高水平临床研究的需要；液相色谱-紫外衍生化法具有专一的特点，但灵敏度又很难适合体内低浓度的多胺测定；免疫法虽操作相对简便，但对各多胺分离能力差，测定交叉干扰严重，且实施价格较高，对临床后续研究性价值不高。液相色谱-质谱联用技术具有专一性强、灵敏度高的优点，在体内药物分析、内源性物质测定分析和代谢组学相关领域方面已有成熟的应用，是近年来应用迅速发展的分析测试技术。

由于多胺是小分子化合物，具有结构简单、在体内含量低的特点，而临床检测需建立快速、灵敏、准确、经济的测定方法，因此实际能够应用在临床上的多胺检测方法目前尚未完全建立。 

发明内容

本文目的是采用简便的预处理方法、灵敏的检测手段，建立尿液中多胺的分析方法，实现尿液中痕量多胺的检测，使多胺在癌症的预诊、治疗评价以及在抗癌药物的开发研究中发挥重要作用。 

本发明所述多胺类物质优选1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、酰化精胺、精脒、精胺。 

本发明是这样实现的： 

（1）尿液样本预处理：

a．取一定量采集的尿液，加入一定量内标溶液及一定量高氯酸，涡旋混匀后，离心取上清液；

b．取经a步骤处理后的上清液，加入衍生化试剂、碱化试剂，涡旋混匀，在超声条件下反应后加入中止反应试剂、萃取溶剂后震荡，上层有机溶液转移吹干，加入甲醇超声离心后取上清液，进行LC -MS分析。

（2） 液相分离： 

a．采用C₁₈作固定相，

b．流动相A：甲醇，流动相B：水。

    梯度洗脱并控制流速 

（3）  MS 测定：

电喷雾离子源，正离子扫描。

步骤（1）a操作中，内标溶液优选物质量浓度为500ng/ml的1,6-已二胺，高氯酸的质量浓度优选5%-9%。 

步骤（1）b操作中，衍生化试剂、碱化试剂的加入顺序优选先加入碱化试剂，后加入衍生化试剂。 

步骤（1）b操作中，碱化试剂优选0.5 mol/L至2 mol/L氢氧化钠溶液。 

步骤（1）b操作中，衍生化试剂为苯甲酰氯溶液和乙腈的混合溶液，苯甲酰氯质量浓度优选1%-5%。 

步骤（1）b操作中，超声反应时的温度优选30^oC。 

步骤（1）b操作中，中止反应试剂优选饱和氯化钠溶液。 

步骤（1）b操作中，萃取溶剂优选乙醚。 

步骤（2）中梯度洗脱优选14分钟内甲醇体积浓度由55 %上升到74 %，控制流速优选在0.8 ml/min-1.2 ml/min，柱温优选20 ^oC-40 ^oC，进样体积优选10 μL-25 μL。 

步骤（3）中，质谱条件优选毛细管电压：4200-4500 V，雾化气流速: 1.1-1.3 Bar，干燥气流速: 5.0-7.0 L ? min^-1，干燥气温度: 210-230 ^oC，扫描范围: 50-900 m/z，定量离子: 1,3-丙二胺 m/z: 303.1，腐胺 m/z: 319.1，尸胺 m/z: 333.2，酰化精胺m/z: 579.3，1,6-已二胺(内标)m/z: 347.2，精脒 m/z: 480.2，精胺 m/z: 641.3。