[发明专利]一种高产氨肽酶的重组大肠杆菌及其构建方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种高产氨肽酶的重组大肠杆菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

氨肽酶是一类能够水解蛋白质和多肽N端氨基酸的外切蛋白水解酶，广泛存在于动植物及微生物中。氨肽酶在许多生物加工过程中起着重要的作用，如蛋白质的消化和分解、蛋白质的成熟、激素分泌的调节及细胞周期的控制。毫无疑问，许多疾病的引发都与氨肽酶有关，包括炎症、白内障、糖尿病、中风、囊性纤维化甚至癌症和艾滋病等。因此，正确了解氨肽酶的催化机制以及一些影响氨肽酶发挥正常生物学功能的因素对预防和治疗这些疾病有着重要的作用。

目前，微生物发酵生产氨肽酶存在产量低的问题，如何提高微生物法生产氨肽酶的产量成为迫切需要解决的问题。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是提供：一种高效表达氨肽酶的重组大肠杆菌，是将来源于枯草芽孢杆菌Zj016的去除了信号肽的氨肽酶基因导入E.coli BL21(DE3)得到的基因工程菌。

所述枯草芽孢杆菌Zj016，详见田亚平，须瑛敏。一种枯草芽孢杆菌氨肽酶的纯化及酶学性质[J].食品与发酵工业，2006，32(3)：7-10.

所述去除了信号肽的氨肽酶核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还要解决的技术问题是提供一种所述高效表达氨肽酶的大肠杆菌基因工程菌的构建方法。

为解决上述技术问题，步骤如下：

1)收集枯草芽孢杆菌Zj016分泌的纯酶进行N端氨基酸序列测定；

2)将测得的氨基酸序列在NCBI数据库中比对，根据与其一致性最高蛋白的核苷酸序列并设计引物P1和P2克隆氨肽酶基因，将所述氨肽酶基因转化E.coli JM109，得到重组质粒PUC19-SAP；

3)分析氨肽酶核苷酸序列，设计引物P3和P4克隆出不含信号肽的编码成熟氨肽酶的基因；将所述成熟氨肽酶的基因与载体pET-28a(+)连接，挑选阳性质粒转化E.coli BL21(DE3)。

所述引物P1核苷序列如SEQ ID NO.2所示。

所述引物P2核苷序列如SEQ ID NO.3所示。

所述引物P3核苷序列如SEQ ID NO.4所示。

所述引物P4核苷序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明提供了一种高产氨肽酶的重组大肠杆菌及其构建方法，该方法简单有效，构建的重组大肠杆菌能高效表达氨肽酶，能为后期研究氨肽酶的特性、结构等提供所需蛋白。

附图说明：

图1：野生菌纯酶N端测序结果。

图2：枯草芽孢杆菌氨肽酶基因的克隆结果(1：目的基因)。

图3：重组质粒PUC19-SAP双酶切结果，(1：PUC19，2：目的基因)。

图4：重组质粒pET-28a(+)-AP双酶切结果(1：pET-28a(+)；2：目的基因)。

图5：重组大肠杆菌表达SDS-PAGE结果(M：marker；1：未诱导；2：诱导；3：目的蛋白)。

具体实施方式：

材料和检测方法

LB培养基：：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，pH 7.0。

TB培养基：1.2％胰蛋白胨，2.4％酵母提取物，0.4％甘油，17mM KH₂PO₄，72mMK₂HPO₄。

氨肽酶活性测定方法：以L-亮氨酸-对硝基苯胺为底物，在50mM pH 8.5的Tris-HCl缓冲液中加入稀释一定倍数的酶液和底物(1mM)，50℃水浴反应10min，在405nm下测定吸光度。酶活单位定义：在50℃下，1min分解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生1μM对硝基苯胺所需的酶量为一个酶活单位(1U)。

实施例1：