[发明专利]鹅原代肝细胞的分离培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及鹅原代肝细胞的分离培养方法。

背景技术

肝细胞是肝的唯一实质细胞，是肝内数量最多、体积密度最大的细胞群。原代培养的肝细胞不受体内神经内分泌系统的复杂影响，且能保持许多肝脏特异性功能，并维持对一些激素的反应性，能较好反映体内代谢情况，因此，原代培养的肝细胞是研究动物物质代谢及其调节机制的理想模型。鹅具有生产肥肝的优良性能，目前研究鹅肥肝生成机制是一个热点。分离鹅肝细胞，并进行原代培养，观察其细胞形态及其活性，为研究鹅肥肝生成的调控机制打下了良好基础。

肝细胞的分离始于20世纪60年代中期。早期主要用机械法，但该法对肝细胞损伤大，细胞存活率低。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞，目前广泛应用的是胶原酶消化法。

目前，人和小鼠等的肝细胞原代培养模型都有报道，不同动物的分离方法存在差异。鹅原代肝细胞分离培养尚未有研究报道。

发明内容

本发明提供一种鹅原代肝细胞的分离培养方法，本发明解决了目前尚未有完善的鹅原代肝细胞分离培养方法的问题。

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：鹅原代肝细胞的分离培养方法，其操作步骤是：

(1)将禁食11～13h的鹅腹腔注射戊巴比妥钠，注射量是28～31mg/kg体重和肝素钠95～105IU/kg体重，待其麻醉，仰卧位固定，腹部被皮消毒；

(2)沿鹅腹部正中线切开腹腔，快速取出完整的肝脏，用38～40℃生理盐水把肝脏表面洗干净；

(3)洗净的肝用38～40℃前灌流液灌流直至肝变为淡黄色；

(4)再换成38～40℃清洗液冲洗出肝中前灌流液；

(5)然后再用温度为38～40℃的0.04～0.06％酶灌流液反复灌流，直至肝被膜下组织呈龟背状裂隙；

(6)把肝脏放入一玻璃培养皿中，撕开被膜，将肝脏剪碎；

(7)将剪碎的肝组织和胶原酶液一起倒入一无菌锥形瓶中，38～40℃水浴继续消化5～10min左右；

(8)加入含9～12％胎牛血清的DMEM培养基终止其消化；

(9)然后用200目无菌纱网进行过滤，除去大的细胞团，获得肝细胞悬液；

(10)以900～1000r/min，38～40℃离心肝细胞悬液1.8～2.2min，弃上清，在沉淀中加入PBS，再次制成肝细胞悬液；

重复步骤(10)三次，直至肝细胞悬液清亮；

(11)然后往肝细胞悬液中加入含9～12％胎牛血清的DMEM培养基，并把细胞吹打均匀；

(12)用血细胞计数板对细胞进行计数后，用DMEM培养液稀释到3～5×10⁵个cell/ml的密度，接种到细胞培养皿中，于4～6％CO₂、38～40℃培养箱中培养，使之贴壁；

(13)肝细胞培养2.8～3.2h后，用PBS清洗2～4次，以去掉未贴壁的血细胞和细胞碎片，获得活的原代肝细胞；

(14)然后，加入9～12％胎牛血清的DMEM培养基，于4～6％CO₂、38～40℃培养箱中培养。

上述步骤中所述的前灌流液制作步骤是：在500ml去离子水中依次加入8g NaCl，0.078g NaH₂PO₄2H₂O，0.4g KCl，0.151gNa₂HPO₄2H₂O，0.35g NaHCO₃，0.19g EDTA，2.38g HEPES，溶解后用1M NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，高温高压灭菌30min。

上述步骤中所述的清洗液是：在500ml去离子水中依次加入8gNaCl，0.078g NaH₂PO₄2H₂O，0.4g KCl，0.051g Na₂HPO₄2H₂O，0.35gNaHCO₃，0.14g CaCl₂，2.38g HEPES，溶解后用1M NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，高温高压灭菌30min。