[发明专利]一种抗肿瘤血管生成的适体分子及制备方法

权利要求书

1.一种抗肿瘤血管生成的适体分子，其特征在于，其序列为：5′-ACTTCCAGTCTATTCAATTGGGCCCGTCCGTATGGTGGGTGTGCGTGGCCACGAGTTTTAAAAAAAAAAACCAAGCTTTTTTTTGATCATGT-3′；该适体分子(V5aE+)在离适体分子与靶分子抗VEGF165特异结合的核心茎环区域较远的位置插入一个AT接头和一个核酸酶作用位点，其中AT接头中A和T碱基的数目分别是8个；酶作用位点包含DNA连接酶酶连位点以及DNA内切酶(RsaI)酶切位点，位置在核心茎环区域与AT接头之间，环化修饰的分子可通过环到环循环反应大量制备，环化效率通过实时荧光定量RCA检测。

2.一种如权利要求1所述的抗肿瘤血管生成的适体分子的制备方法，其特征在于包括如下步骤：首先对环化适体分子V5aE+进行磷酸化和环化反应，然后进入环到环循环反应；每次环到环循环反应经历两轮反应，每轮反应依次为滚环扩增反应、酶切反应和环化反应。

3.如权利要求2所述的一种抗肿瘤血管生成的适体分子的制备方法，特征在于：所述的环化反应使用的酶连辅助序列LV5aE+5′-CCCAATTGAATAGACTGGAAGTACATGATCAAAAAAAAGCT-3′；或酶连辅助序列LV5aE-为5′-AGCTTTTTTTTGATCATGTACTTCCAGTCTATTCAATTGGG-3′。

4.如权利要求2所述的一种抗肿瘤血管生成的适体分子的制备方法，其特征在于：所述的滚环扩增反应使用的引物序列即酶连辅助序列LV5aE+为：5′-CCCAATTGAATAGACTGGAAGTACATGATCAAAAAAAAGCT-3′；或酶连辅助序列LV5aE-为：5′-AGCTTTTTTTTGATCATGTACTTCCAGTCTATTCAATTGGG-3′。

5.如权利要求2所述的一种抗肿瘤血管生成的适体分子的制备方法，其特征在于：所述的酶切反应使用的酶切辅助序列DV5aE+为5′-GAATAGACTGGAAGTACATGATC-3′；或酶切辅助序列DV5aE-：5′-GATCATGTACTTCCAGTCTATTC-3′。

6.如权利要求2或3所述的一种抗肿瘤血管生成的适体分子的制备方法，其特征在于所述的环化反应条件为：将1份待环化的磷酸化线性适体与1-5份酶连辅助序列混合，在Taq DNA连接酶缓冲液中，95℃孵育5分钟，然后缓慢冷却到室温；加入Taq DNA连接酶，94℃孵育4分钟；然后按照以下程序完成15个循环：94℃30秒，45℃5分钟；最后95℃15分钟灭活Taq DNA连接酶；未环化的DNA产物用exoI+exoIII降解：上述环化反应产物混合物，加入Exo I和Exo III，37℃孵育30分钟，80℃孵育5分钟灭活外切酶，得到环化DNA适体分子。

7.如权利要求2或4所述的一种抗肿瘤血管生成的适体分子的制备方法，其特征在于所述的滚环扩增的反应条件为：将1份环化DNA分子与10-1000份的酶连辅助序列混合，加入到Bst DNA聚合酶缓冲液中，再加入2百万份dNTPs，再加入Bst DNA聚合酶，65℃120分钟；80℃孵育20分钟灭活Bst DNA聚合酶。

8.如权利要求2或5所述的一种抗肿瘤血管生成的适体分子的制备方法，其特征在于所述的酶切反应的反应条件为：将1份RCA产物与10万份酶切辅助序列加入到RsaI内切酶缓冲液中，再加入RsaI限制性内切酶，37℃孵育3.0小时；65℃20分钟灭活RsaI内切酶。