[发明专利]玉米伤口诱导型启动子及活性分析

说明书

技术领域

本发明属生物工程技术领域，涉及一段DNA序列，在低温胁迫下它可以作为启动子调控基因的表达，具体涉及一种来源于玉米脂氧合酶基因ZmLOX11并在植物中高度表达的伤口诱导型启动子序列。 

背景技术

中国是一个人口众多的农业大国，粮食安全生产事关国计民生与社会稳定。我国是农业生物灾害(病害、虫害、鼠害、草害)多发和重发的国家。据调查，我国常见农作物有害生物达1600多种，其中造成严重危害的有近100种，年发生面积达70亿亩次。联合国粮农组织的研究结果表明，农作物病虫害自然损失率在37％以上，据此测算，若不采取防控措施，我国每年因病虫危害将损失粮食3000亿斤。目前，重大农作物病虫害的控制往往依赖化学防治，农药的使用不仅增大生产成本，而且其反复施用不可避免地带来环境污染、抗药性及农产品农药残留等一系列问题。因此，加强植物病害致病机理、寄主植物抗病机制及培育抗病品种等关键问题的研究和昆虫取食作物后植物体的防御机制可为植物病虫害控制新策略的制定与防治关键技术的研发奠定理论基础，从而进一步为我国农作物优质高产、降低生产成本、减少环境污染与农产品农药残留提供技术保障。 

自转基因技术成熟以来，科学家们已经得到了很多转基因品种。然而，由于转入的基因大多数是由组成型启动子驱动表达的，组成型启动子具有高效表达、且在植物整个生长期都表达的特点，这使得大部分的转基因作物都具有植株矮小的特点，不利于植物的正常生长。而诱导型启动子在某些特定的物理或化学信号的刺激下，能够快速有效地诱导基因的转录，来抵御不良环境的影响。诱导型启动子独特的优点是它能根据自身的需求在特定的组织器官、环境下诱导基因转录，解决组成型启动子面对的问题。迄今为止，从玉米中分离的逆境诱导型的启动子很少。 

许多植物都能对人为创作或病虫害造成的机械损伤作出反应，使某些伤口诱导基因表达。这些伤口诱导的基因编码多种蛋白产物：包括几丁质酶、蛋白酶抑制剂和脂氧合酶等。RCH8是水稻的I类几丁质酶基因，中科院植物生理研究所的李红等在PUC19载体质粒中构建了一组5’端不同程度缺失的RCH8基因启动子与GUS报告基因翻译融合的重组质粒。用PEG法转入烟草原生质体中，通过测定GUS酶活性发现RCH8启动子-1016～676bp之间的DNA序列缺失后表达活力显著下降，缺失到-68bp处的启动子仅有很低的活力。此外，泛素核糖体蛋白融合基因ubi3、马铃薯pin2基因启动子同样也受到伤口诱导。 

利用伤口诱导型启动子驱动抗病虫基因的高效表达，从而改良作物的抗病虫性成为目前研究的热点。然而，目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此，对于新的抗病虫相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这 些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种伤口诱导型启动子序列，该启动子序列能够诱导目的基因高水平表达，而且该启动子来源于玉米脂氧合酶基因ZmLOX11。 

本发明的第二个目的是提供一种用于植物转化的伤口诱导型启动子真核表达载体，该载体指导高水平表达目的基因ZmLOX11的伤口诱导型启动子序列和5’非翻译区。 

本发明的第三个目的是提供一种所述载体转化的转基因玉米成熟胚。该转基因玉米胚能反映启动子诱导活性的高低。 

为实现上述目的，本发明克隆了玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的伤口诱导型启动子区，并构建了用于植物转化的载体，所述载体包含带有ZmLOX11基因的5’非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在玉米成熟胚中诱导表达，并观察到该启动子与伤口诱导相关的高水平活性。 

本发明提供一种获得的玉米伤口诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1888bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，伤口可以在植物中诱导本发明所述的启动子的高水平活性。 

获得的玉米伤口诱导型启动子序列源自玉米脂氧合酶基因ZmLOX11。 

一种克隆得到的玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的5’非翻译区包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的+1bp至+104bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，本发明所述的玉米脂氧合酶基因ZmLOX11的5’非翻译区能通过增强导入植物中的目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。