[发明专利]对南方根结线虫具有杀虫增效作用的蛋白组合物Cry6A/Cry55A及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一组来自于苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫晶体蛋白组合物，它们对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)具有明显的杀虫增效作用，可用于防治对农业生产危害巨大的南方根结线虫。

背景技术

植物病原线虫是一类重要的病原生物，其中许多种是国际公认的毁灭性有害生物。据估计，植物病原线虫造成全球主要农作物的年损失率约为12.3％，每年直接经济损失超过1000亿美元，在整个农业害虫造成的损失里几乎占到了一半(Chitwood，2003)。其中危害最大了又为植物根结线虫和包囊线虫，而根结线虫中危害最大的有南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)和爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)(Li et al.，2008)。

植物根结线虫主要生活在土壤中或寄生于植物体内，危害隐蔽，防治比较困难。目前应用于植物根结线虫防治的方法主要有化学防治、物理防治，生物防治等。化学防治所使用的化学农药多属于高度农药，对植物本身以及非靶标生物也有危害，而且不利于土壤活化、天敌繁衍和环境保护(陈品三，2001)。物理和栽培方法主要是指通过轮种、休闲、旱季耕翻、覆盖和利用抗病和耐病品种等措施来避免线虫的危害。但是由于现代农业中，土地资源有限，耕种指数高，以及受地域气候条件的限制，这种方法的作用也非常有限。生物防治指利用线虫天敌、微生物和高等植物产生的杀虫蛋白或拮抗性代谢物、以及基因工程手段培育抗性作物等来防治植物线虫。通过生物防治的手段来防止植物病原线虫体现出了巨大的优势和应用前景，将对保护环境，有效实现农产品的优质安全生产，扩大我国农副产品外销市场，推进绿色农业的发展，促进农村农村经济繁荣等起到重要的作用。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种在土壤等自然环境中广泛存在的革兰氏阳性细菌，其在芽胞形成过程中可产生具有杀虫活性的蛋白类伴胞晶体(Cry蛋白)。苏云金芽胞杆菌是目前世界上应用最广泛的生物杀虫剂，占整个生物农药产业90％以上的市场。其杀虫基因也广泛应用于转基因植物，在抗虫植物的培育中发挥了重要作用。部分苏云金芽胞杆菌菌株对植物病原线虫具有较高的毒杀活性。苏云金芽胞杆菌对植物病原线虫的作用最早报道于上世纪70年代。1972年Prasad等首先发现Bt β-外毒素对根结线虫的卵和幼虫有较高的毒杀活性。20世纪80年代中期Bone等发现Bt以色列亚种(subsp.israelensis及库斯塔克亚种(subsp.kurstaki)的晶体蛋白对动物寄生线虫蛇形毛圆线虫(Trichostronglus colubr和rmis)的幼虫和卵有很高的毒力，其中以色列亚种的毒素蛋白还可杀死奥斯特线虫(Ostertagia ostertagi)、捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)等动物寄生线虫虫卵，从而首次证实了Bt伴胞晶体蛋白对线虫具有杀虫活性(Bone et al.，1985；1986；1987)。随着研究的不断深入，Bt防治植物病原线虫的效果不断得到肯定。美国Mycogen公司筛选到多株对植物病原线虫有活性的Bt，并申请了多项专利。1988年，Mycogen公司从Bt中克隆到杀线虫基因cry5和cry6，并将克隆到的基因转入了植物，发现对植物病原线虫均有很强的抑制作用，但该公司对cry5和cry6的核酸序列未作公开报道(Bone et al.，1988)。