[发明专利]与青花菜莱菔子苷含量连锁的分子标记的建立

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术工程，特别涉及与青花菜莱菔子苷含量连锁的分子标记及其获得方法。 

背景技术

青花菜(Brassica oleracea var.italica)俗称西兰花、绿菜花等，属十字花科芸薹属甘蓝种，是甘蓝与花椰菜等演变中的一个变种，为一、二年生草本植物，原产于意大利。青花菜柔嫩爽口，风味鲜美，营养丰富，是中西餐配菜的重要原料和营养保健蔬菜，是宾馆、饭店及家庭餐桌上的高档菜肴，也是加工速冻、脱水及保鲜蔬菜出口的重要品种之一。目前世界各国青花菜栽培面积逐年增加，有超过花椰菜的趋势。由于其产品出口创汇价值高，内销市场也日益扩大，近年来，我国青花菜的种植面积不断增加。 

国内外大量医学和营养学研究表明，经常摄食青花菜，可有效降低肺癌、直肠癌、乳腺癌及前列腺癌等多种多种癌症的发病率。美国国家饮食、营养和癌症研究委员会建议多食用青花菜等十字花科蔬菜来作为降低癌症发生率的措施。现研究证实青花菜具有的抗癌特性主要与其中的4-甲基亚磺酰丁基硫苷(glucoraphanin，又称葡萄糖莱菔子苷，简称RAA，以下简称莱菔子苷)有关，该硫苷经植物黑芥子酶(myrosinase，EC 3121311)或人体胃肠内微生物水解后产生的萝卜硫素(sulforapane，简称SF，1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷)，是迄今为止发现的蔬菜中抗癌功能最强的天然植物活性物质，具有极强的抗氧化能力，并诱导人体细胞产生II型致癌因子解毒酶类，同时抑制I型酶的产生，提高机体自身抗癌系统能力。已有国外大量研究表明，青花菜是十字花科蔬菜中莱菔子苷含量最丰富的蔬菜，而且不同青花菜品种中含量差异明显。 

近年来，随着环境污染程度的加重，人类癌症的发病率有逐渐上升的趋势，因此培育具有防癌功效的高莱菔子苷含量青花菜品种，对人类保健具有重大意义，并具有重要的科学价值和意义，且能够带来极大的经济和社会效益。因此筛选培育莱菔子苷含量高的青花菜品种，让人们在饮食中就能够轻松地摄取更多的抗癌物质，已成为目前青花菜育种的一个重要研究课题和育种目标。 

但是目前国内关于青花菜莱菔子苷方面的研究却处于刚起步阶段，对莱菔子苷含量的测定主要是利用反相高效液相色潽法，该方法需要待青花菜花球收获后，用液氮迅速冷冻，经真空冷冻干燥粉碎后，经过提取、脱硫及反相高效液相色潽分析等步骤才可得到含量值，这种测定方法周期长、工作量大、易受环境影响、误差大，因此给培育莱菔子苷含量高的青花菜品种造成了困难。分子标记辅助选择是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种，该技术是将分子标记技术与传统育种学相结合，用稳定、可靠的DNA分子标记代替易受环境影响的表型标记，对育种材料进行筛选。目前国内外育种中分子标记辅助 选择技术的应用越来越普遍，我国也已经开展了相关的应用研究，但是有关青花菜分子标记的研究工作在国内外都是刚刚起步，远远落后于小麦，油菜，水稻等大田作物。利用分子标记辅助育种的关键是筛选到与目标基因紧密连锁的分子标记。因此，开发研究一种与青花菜莱菔子苷含量连锁的分子标记的建立方法，以满足目前育种需要，将具有十分重要的意义。 

发明内容

本发明的目的是公开一种与青花菜莱菔子苷含量连锁的分子标记及其建立方法，为分子标记辅助选育高莱菔子苷含量青花菜品种服务。 

本发明的实施方案如下： 

与青花菜莱菔子苷含量连锁的分子标记，是通过以下方法筛选出的： 

(1)利用反相高效液相色潽法连续三年对大量青花菜自交系材料和品种花球中莱菔子苷含量进行测定，并根据测定结果选取含量稳定的8个高含量材料和6个低含量材料。 

(2)步骤(1)所述的14个材料，每个材料选取5个单株，每个单株取等量叶片，混合提取基因组DNA，基于BSA法，按照高低含量品种混池，分别建成高莱菔子苷含量基因池与低莱菔子苷含量基因池。 

(3)采用SRAP标记对步骤(2)所述的高低莱菔子苷含量基因池进行筛选，再利用获得的候选引物对步骤(1)所述的8个高含量材料和6个低含量材料进行PCR扩增，验证多态片段的稳定性。 

(4)筛选出一个与莱菔子苷含量有关的标记M2E8-450，该标记在高莱菔子苷含量基因池中较低含量池多扩增出一条特异条带，回收测序，获得如序列表SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，长度为464bp，设计得到权利要求2所示的引物对。