[发明专利]人脑组织特异性基因LRRC4单抗及其制备和应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及人脑组织特异性基因LRRC4单抗及其制备和应用方法，属于基因工程领域。

背景技术

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，约占中枢神经系统原发性肿瘤的40-50％，综合发病年龄高峰在30-40岁，或10-20岁，具有发病率高、复发率高、死亡率高及治愈率低等特点。由于胶质瘤呈“树根状”浸润性生长，与周边正常脑组织无明显分界，仅通过手术治疗难以达到完全根除，常联合放、化疗及免疫治疗等方案。尽管如此，胶质瘤细胞增殖快、易侵袭，以至于它能有效地“逃脱”上述治疗方案，最终导致患者死亡。虽然目前随着生命科学研究的发展，胶质瘤的诊断和治疗方法在不断改进，但其中位生存期仍没有明显提高，尤其是胶质母细胞瘤，其中位生存期仅为9-12个月，而间变性星形细胞瘤其中位生存期也仅为3年。因此，寻求新的治疗途径和方法，例如靶向治疗、基因治疗等成为热门研究领域。

我们前期运用EST介导的定位候选克隆策略，从多种肿瘤高频缺失区7q31-32克隆了一LRR超家族新成员LRRC4，该基因编码一种跨膜蛋白，其胞外区包含9.5个LRR结构域。研究发现LRRC4在正常人脑组织中相对特异高表达，而在多种原发性脑瘤中表达明显下调甚至缺失，尤其是胶质瘤。(王洁如，钱骏，董利，李小玲，谭琛，李江，张必成，周洁，李桂源.富亮氨酸重复超家族新成员LRRC4的克隆与在脑瘤中的表达分析.生物化学与生物物理进展.2002，29(2)：233-239.)进一步研究发现，LRRC4能通过MAPK信号通路抑制胶质母细胞瘤细胞系U251的生长和成瘤潜能，是一个新的候选抑瘤基因。为深入研究LRRC4的生物学功能，寻找与其直接作用的交互蛋白，明确其所参与的具体信号转导通路，制备高效特异的抗LRRC4抗体是非常必要的。

申请人在前期工作中发现，LRRC4全长蛋白整体亲水性不高，经多次尝试难以诱导其表达，选择亲水性好、抗原指数高且序列特异的一段多肽作为动物的免疫原不失为一种好的方法。His标签是由6个组氨酸构成的短肽，专门设计用于重组蛋白的表达纯化，His标签与其它标签相比具有很多明显优势：①对金属离子(如镍、钴)有高度的选择性和亲和力；②与金属离子的结合不受变性剂(如尿素、胍)的影响；③温和多样的洗脱条件。因此，选择LRRC4基因编码区中特定的一段核苷酸序列，利用His标签建立一个基于融合蛋白的高效的蛋白表达和纯化系统，是本发明的工作基础。

发明内容

本发明的目的在于提供高效特异的抗人脑组织特异性基因LRRC4的单抗及其制备和应用方法。

本发明单抗的制备方法如下：应用DNASTAR软件分析LRRC4(Genebank ID：64101)全长蛋白的亲水性、抗原指数及表位可能性等，并结合NCBI数据库中的Protein Blast进行序列特异性分析，选取其第460-521位，长度为62个氨基酸，序列为ETTEISPEDTTRKYKPVPTTSTGYQPAYTTSTTVLIQTTRVPKQVAVPATDTTDKMQTSLDE，的多肽作为动物的免疫原。

首先应用多聚酶链式反应克隆编码该多肽的核苷酸序列，构建包含该核苷酸序列的His融合表达载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导His融合蛋白表达，Ni柱亲和纯化后免疫Balb/c小鼠，然后分离其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，经阳性克隆筛选及亚克隆化后制备腹水，辛酸-硫酸铵沉淀法纯化获得抗LRRC4单抗。应用该抗体进行western blot及细胞免疫荧光实验，均显示出该抗体的特异性和高效价。

一种人脑组织特异性基因LRRC4单抗是由上述的方法制备而成的单抗。

一种人脑组织特异性基因LRRC4单抗用于制备诊断和治疗胶质瘤的药物或试剂。

应用本发明抗体可深入研究LRRC4的生物学功能，明确其所参与的具体信号转导通路，有助于进一步阐明胶质瘤发生发展的机制。此外，由于LRRC4在正常人脑组织与胶质瘤组织中的表达水平存在明显差异，因此抗LRRC4单抗在胶质瘤的早期诊断和治疗方面具有潜在的应用价值。

附图说明

图1：DNASTAR软件分析LRRC4全长蛋白的特性；

图2：His融合表达质粒的酶切鉴定；(M1、M2：DNAMarker；1：His融合表达质粒)

图3：His融合蛋白的诱导表达；

图4：应用抗LRRC4单抗进行Western blot，检测LRRC4蛋白的表达水平；

图5：应用抗LRRC4单抗进行细胞免疫荧光实验，检测LRRC4蛋白的细胞定位。