[发明专利]一种新型食品防腐剂抗菌肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产食品防腐剂的方法，具体的说是一种新型食品防腐剂抗菌肽的制备方法。

背景技术

在食品工业中，各类食品的防腐保鲜始终是一个亟待解决的重要问题，据估计，我国每年约有20％～30％的食物因食物腐败而遭到严重的损失。食品腐败变质不仅降低食品的营养价值，严重时还会造成食物中毒。食品腐败的原因有多方面，包括物理、化学、酶及微生物四个方面的因素，其中微生物作用最为严重。食品在加工、保藏、消费过程中容易受到细菌、酵母菌、霉菌等一系列微生物的侵染，这就决定了食品防腐剂在食品工业中将发挥至关重要的作用。通过防腐剂抑制或杀灭微生物，可以起到阻止、延缓食品的变质，甚至提高食品的品质的作用。为了延长食品的保藏期限，人们在食品加工过程中采用不同的手段使微生物丧失活性，延缓或阻止其生长。添加防腐剂是其中一种使用方便、非常有效的食品防腐方法，因而被普遍采用。食品防腐剂一般分为合成防腐剂和天然防腐剂，过去人们大都使用合成防腐剂，如苯甲酸、山梨酸及其盐类、对羟基苯甲酸脂类等。而人工合成的防腐剂具有诱发癌症的发生、致使出现畸形婴幼儿和引起食物中毒等问题，同时人工防腐剂中的苯甲酸盐能够引起食物中毒，而亚硝酸盐和硝酸盐容易造成癌症的发生。

随着生活水平的提高，人们对防腐剂的要求也越来越高，不但要求防腐剂安全、无毒，而且要求防腐剂营养化和功能化。天然防腐剂具有抗菌性强、安全无毒、水溶性及热稳定性好、作用范围广等优点，而且还具有一定的营养价值，但是目前天然防腐剂的合成方法复杂，不易合成。

抗菌肽是生物在长期进化过程中为适应环境、求得生存而产生的免疫活性分子，具有选择性效应，分子质量小、无抗原性，被认为是天然免疫的重要介质。抗菌肽在宿主对抗病原入侵的免疫防御中起着极其重要的作用，因此被形象地称为“天然抗菌剂”或“阳离子宿主防御肽”，是重要的分子屏障。

发明内容

本发明针对上述问题，提供了一种新型食品防腐剂抗菌肽的制备方法，其制备方法简单，操作方便等优点，保存食品时所需剂量低、效果明显。

本发明涉及到以下菌种和试剂：

巴斯德毕赤酵母X-33菌和大肠杆菌JM109为普通未变异的巴斯德毕赤酵母X-33菌和大肠杆菌JM109，通过实验室提取或市场购买均能得到，而本发明中的巴斯德毕赤酵母X-33菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心和大肠杆菌JM109购于中国普通微生物菌种保藏管理中心；

所述的载体为酵母表达载体pPICZ-α-A，在市场上即可购买得到，在本发明中酵母表达载体pPICZ-α-A购于上海英俊生物技术有限公司，其产品为（GLD195）；

DNA凝胶回收试剂盒购买于碧云天生物技术研究所，该试剂盒中自配有成品的DNA纯化结合液，洗涤液，洗脱液，DNA纯化柱，收集管；

限制性内切酶XhoⅠ、限制性内切酶 Xba I、限制性内切酶BamHⅠ缓冲液、T4DNA连接酶、10倍T4DNA连接酶缓冲液、限制性内切酶BglⅡ、10倍限制性内切酶BglⅡ缓冲液、限制性内切酶SacⅠ和10倍限制性内切酶SacⅠ缓冲液购买于大连宝生物工程有限公司；

浓度为2.5mmol的三磷酸脱氧核糖核苷混合液、10倍PCR缓冲液、浓度为25mmol Mg²⁺的PCR 缓冲液、Taq DNA聚合酶购买于上海生工生物工程技术服务有限公司；

通用鉴定引物5’AOX和引物3’AOX购买于上海生工生物工程技术服务有限公司；

一种新型食品防腐剂抗菌肽的制备方法，

步骤一、抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因的设计与合成：

1）根据全球公共序列数据库Genebank中记载序列号为P80409的抗菌肽Metnikowin-Ⅱ的核苷酸序列为模板，在抗菌肽Metni kowin-Ⅱ的核苷酸序列后端加入6个组氨酸，即加入6个cat的核苷酸序列，形成抗菌肽Metnikowin-ⅡH，以抗菌肽Metnikowin-ⅡH的核苷酸序列为模板，依据毕赤酵母的偏嗜性，分别在抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因的前端加入限制性内切酶xho?的酶切位点，后端加入限制性内切酶XbaⅠ的酶切位点，并在限制性内切酶XbaⅠ的酶切位点前端加入终止密码子UAA，将设计好的核苷酸序列进行合成；

其中抗菌肽Metnikowin-ⅡH的核苷酸序列为：

GTTGATAAACCAGATCTTAGACCAAGACCATGGCCAAGACCAAATcatcatcatcatcatcat