[发明专利]蚓激酶干粉的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蚓激酶干粉的制备方法，属于生物工程和酶制剂制备技术领域。

背景技术

蚓激酶的提取纯化通常是通过蚯蚓匀浆、盐析、离心、超滤、凝胶层析和离子交换层析等一系列步骤进行分离纯化，一般可以获得较高纯度的单个或数个组分的蚓激酶。由于蚯蚓种类较多，故分离得到的蚓激酶的组分大小不一，有报道认为其分子量是18～42KD，pI3～5，具有激酶和纤溶酶活性的丝氨酸蛋白酶,并在热稳定性和酸稳定性上有许多相似之处。

国内，工业上通常用硫酸铵盐析的方式提取蚓激酶，硫酸铵用量大，成本高，如果硫酸铵不进行回收或回收不当会造成原料浪费及环境污染，而且蚓激酶酶活不高。实验室采用的层析、离子交换、分子筛、凝胶电泳等手段从不同品系的蚯蚓中获得多种纤溶酶单纯组分，操作麻烦，流程长，且酶活力损失很大，比活力也不高, 一般在200～900 Uk/mg，不适合工业化生产。如何从蚯蚓中简单高效地提取蚓激酶，并进行工业化推广，是目前要解决的当务之急。

中国专利CN1414095 A公开了一种用聚丙烯酸钠盐制备蚓激酶，蚓激酶活性260Uk/mg，生产收率3.5％左右。

中国专利CN1089369C公开了一种用超滤、亲和层析、离子交换及分子筛等技术组合方式分到了3种有纤溶活性的蚓激酶。后续操作繁琐，成本较高，不利于规模化推广生产。 

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足提供一种蚓激酶干粉。

本发明的又一目的在于提供一种蚓激酶干粉的制备方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种蚓激酶干粉，其特征是包括如下：从蚯蚓中提取制备的一组蛋白水解酶，棕色粉末，味腥，有吸湿性，按干燥品计算，每1mg效价大于1200U尿激酶单位。

一种蚓激酶干粉的制备方法，其主要特点是包括以下步骤：

（1）清洗蚯蚓：用自来水浸泡蚯蚓，洗净蚯蚓体表泥污及蚯蚓体内排泄物，并沥干；

（2）蚯蚓匀浆：称取0.8-1.2重量份沥干的蚯蚓，加入6-10重量份的 0.9%-2%的氯化钠盐水，在匀浆机中匀浆5分钟。匀浆液室温静zhi，放置3.5-4.5小时；

（3）热变性：匀浆液放入50℃-55℃恒温水浴锅中，热变性0.8-1.2小时；

（4）离心：变性后的匀浆液通过离心机5000-10000rpm离心8-10分钟，留上清液；

（5）超滤：上清液通过截留分子量7-9k的超滤膜，进行除盐及小分子；浓缩3.5-4.5倍；

（6）真空冷冻干燥：超滤液进行真空冷冻干燥，冷冻时间2.5-3.5小时，冷冻温度-60℃以下，干燥真空度20pa以下，加热温度不超过50℃，干燥时间10-12小时，即可得到蚓激酶酶粉。

本发明的有益效果如下：

（1）本发明利用蛋白质在低盐浓度下溶解的方法，提取蚓激酶，与盐析沉淀蛋白质提取蚓激酶相比，酶活损失小，盐的用量小，提高了酶活，降低了成本。本发明酶活1350U/mg,得率5%左右；

（2）本发明利用蚓激酶的热稳定性，采用热变性法去除杂蛋白，进一步提高了蚓激酶的纯度，操作简单，效果明显，与对照相比酶活提高了1.7倍；

（3）本发明工艺简单，流程短，得率大，酶活较高，适合工业化推广生产。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1： 一种蚓激酶干粉，包括如下：从蚯蚓中提取制备的一组蛋白水解酶，棕色粉末，味腥，有吸湿性，按干燥品计算，每1mg效价大于1200U尿激酶单位。

实施例2：一种蚓激酶干粉的制备方法，其特征是包括以下步骤：

（1）清洗蚯蚓：用自来水浸泡蚯蚓，洗净蚯蚓体表泥污及蚯蚓体内排泄物，并沥干；

（2）蚯蚓匀浆：称取沥干的蚯蚓500g，加入4L 0.9%-2%的氯化钠盐水，在匀浆机中匀浆5分钟。匀浆液室温静止，放置4小时；

（3）离心：匀浆液通过离心机5000-10000rpm离心10分钟，留上清液；

（4）超滤：上清液通过截留分子量8k的超滤膜，进行除盐及小分子；4L上清液，超滤后体积为1L,浓缩4倍；

（5）真空冷冻干燥：超滤液进行真空冷冻干燥，冷冻时间3小时，冷冻温度-60℃以下，干燥真空度20pa以下，加热温度不超过50℃，干燥时间12个小时，即可得到蚓激酶酶粉。可得到蚓激酶酶粉48g，酶活测定，794UK/mg。