[发明专利]一种人染色体P16基因检测试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种人染色体P16基因检测试剂盒。具体地，所述检测试剂盒包括用于P16基因检测的探针和杂交缓冲液。应用本发明的人染色体P16基因检测试剂盒可以对人染色体P16基因异常进行准确、快速的检测。

背景技术

P16基因又叫MTS1(multiple tumor suppressor 1，也称多肿瘤抑制基因)或CDKN2A基因，1994年被鉴定，定位于人染色体9p21.3，所编码的产物为一种细胞蛋白依赖性激酶(CDKS)抑制蛋白，它通过p16 INK4αcyclin D1-PRb通路维持机体细胞的有序增殖，直接参与细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂。P16基因纯合子的缺失往往导致细胞的恶性转化，

在人类约50％肿瘤细胞株中发现P16纯合子缺失、突变异常，提示P16基因可能是9p21区域的候补肿瘤抑制基因，它与肿瘤的发生有着十分密切的关系。P16基因已经在肺癌、乳腺癌、宫颈癌、食管癌、脑肿瘤、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、淋巴瘤和黑色素瘤中发现纯合子缺失、蛋白过表达以及无义，错义及移码突变[Kaye FJ.RB and cyclin dependentkinase pathways：defining a distinction between RB and p16 loss in lung cancer[J].Oncogene，2002，21(45)：6908-6914.][Bazan V，ZannaI，Migliavacca M，et al.Prognosticsignificance of p16INK4a alterations and 9p21 loss of heterozygosity in locallyadvanced laryngeal squamous cell carcinoma[J].J Cell Physiol，2002，192(3)：286-293.][Yoshida S，Todoroki T，Ichikawa Y，et al.Mutations ofp16Ink4/CDKN2and p15Ink4B/MTS2 genes in biliary tract cancers[J].Cancer Res，1995，55(13)：2756-2760.][Calero Moreno TM，Gustafsson G，Garwicz S，et al.Deletionof the Ink4-locus(the p16ink4a，p14ARF and p15ink4b genes)predicts relapse inchi ldren with ALL treated according to the Nordic protocols NOPHO 86 and NOPHO 92[J].Leukemia，2002，16(10)：20372045.]，表明P16基因以缺失、扩增、突变等方式广泛参与肿瘤形成，检测P16基因状态有无改变对判断患者肿瘤的易感性、进行高危病例筛选以及预测肿瘤的预后，具有十分重要的临床意义。

染色体核型分析可以进行染色体异常分析，目前广泛应用于培养细胞中染色体及基因异常检测。但核型分析需要对细胞进行培养、制备高质量的中期染色体。其检测结果常受培养失败，染色体形态不佳等因素影响。

免疫组化方法利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量研究。目前主要用于组织标本和细胞标本的检测。该方法常用于蛋白表达水平的检测，但该方法易受检测者的主观影响，结果偏差大。

荧光原位杂交方法利用碱基互补原理，通过分子杂交对已知基因或序列的染色体进行定位及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。荧光原位杂交技术因其操作简单，重复性好、灵敏度特异性高、检测时间相对较短、检测靶区域范围广，可同时用于间期和中期细胞检测而被广泛应用于基因异常的检测。

检索后发现，针对检测样本的差异，临床使用方法也存在较大区别。例如，在血液病中P16基因的检测常使用核型分析或/和荧光原位杂交方法；针对实体肿瘤，如宫颈癌、食管癌等中蛋白表达水平检测常使用免疫组化方法；针对脱落细胞，如膀胱癌的检测中常使用荧光原位杂交方法。

用于P16基因检测的商品化荧光原位杂交探针种类少，通过比较部分商品化探针发现，探针长度从100Kb～400Kb不等。众所周知，探针长度会直接影响杂交信号强度，但同样的，探针过长也会造成高背景，影响检测结果的准确性。