[发明专利]运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测肠出血性大肠埃希菌的试剂及其扩增方法和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及细菌检验技术，具体地说是运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测肠出血性大肠埃希菌O157：H7的的试剂及其扩增方法和检测方法。

背景技术

肠出血性大肠埃希菌O157：H7属于肠杆菌科埃希菌属，是肠出血性大肠埃希菌的主要血清型，能引起的出血性结肠炎。1982年在美国俄勒岗州和密执安州，因食用汉堡包引起的食物中毒的病人粪便中被分离并命名的。据美国疾病控制中心(CDC)报告，每年全国约发现2万多例病人。死亡人数200-500人，以后陆续在全球五大州20多个国家被发现或引起暴发和流行。自82年发现至今，发生规模最大的一次爆发是97年5 月下旬，日本冈山、广岛等县几十所中学和幼儿园相继发生6起集体食物中毒事件，人数多达1600人，导致3名儿童死亡，住院儿童达80人。同时日本仙台和鹿儿岛形成中毒人数过万人，死亡11人，波及44个都府县的爆发性食物中毒，引起全世界的关注。此外美国、加拿大、瑞典、澳大利亚、苏格兰、威尔士等国家和地区也相继报道了散发性感染和暴发流行。我国1988年首次分离到肠出血性大肠埃希菌O157:H7。从已有的流行病学调查资料看，我国也存在散发病例，还没有爆发流行的报道。近几年也通过监测，先后从牛、猪、羊、粪便，肉类等食品中查到肠出血性大肠埃希菌O157:H7。快速、准确的检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7是有效预防和控制肠杆菌感染的前提条件。随着分子生物学的发展，实际工作中的细菌鉴定方法已经从传统的简单生化实验水平上向分子生物学的方法如PCR、探针杂交等技术发展。近期开发出来的交叉引物核酸恒温扩增技术是一种更为高效的分子检测方法，已经被很多国家认同，并大力发展。

发明内容

针对肠出血性大肠埃希菌O157:H7，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种快速、便捷、低成本的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测肠出血性大肠埃希菌O157：H7的的试剂及其扩增方法和检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测肠出血性大肠埃希菌的试剂，包括以下五个引物 ：

SEQ ID NO.1：5’ CAGTCGTACGGGGATGCAG

SEQ ID NO.2：5’ TCAGCAGTCATTACATAAG

SEQ ID NO.3：5’ GCTCTTGCCACAGACTGCGTC

SEQ ID NO.4：5' AGGTTCCGCTATGCGACAT

SEQ ID NO.5：5' GCTCTTGCCACAGACTGCGTCAGTTTCGCCATTCGTTGACTACTT

其中引物序列3的5’端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列4的5’端有生物素荧光基团标记。

核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下：

成分                            浓度            加样量              

Bst酶                          5U/μL           1μL

Bst酶缓冲液                       -             5μL

SEQ ID NO.1：                  10μmol/L        1μL

SEQ ID NO.2：                  10μmol/L        1μL

SEQ ID NO.3：                  10μmol/L        0.5μL

SEQ ID NO.4：                  10μmol/L        0.5μL

SEQ ID NO.5：                  10μmol/L        0.2μL

DNA样品                                         2μL

双蒸水                                           13.8μL

总体积                                           25 μL