[发明专利]一种检测水体沉积物和/或土壤中厌氧氨氧化反应速率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测水体沉积物和/或土壤中厌氧氨氧化反应速率的方法。

背景技术

厌氧氨氧化反应的发现是近十年环境科学领域的重大突破，使人们重新认识氨氧化过程这一氮循环中的限速步骤，也改变了人们对全球氮循环通量的认识。氮迁移转化的传统认识是：氨氮由氨氧化细菌(AOB)在氨单加氧酶(amoA)的催化条件下，氧化为亚硝酸盐，由此开始生物氮循环。而最新研究发现，氨的氧化不仅在有氧条件下进行，还可以在厌氧氨氧化菌的作用下，在厌氧/缺氧的条件下被亚硝酸盐氧化而生成氮气，这一过程定义为厌氧氨氧化(anammox)。

厌氧氨氧化菌在自然界广泛存在，目前已探明，海洋生态系统中24％～67％的氮气由厌氧氨氧化反应完成。但是目前关于厌氧氨氧化反应的研究多限于海洋生态系统中，在大陆表层的研究还很少。厌氧氨氧化反应在自然界中的活性以及对脱氮过程的贡献量是普遍关注的问题，如何准确测定自然界中厌氧氨氧化反应速率并将其与反硝化过程进行区分还是一个难题。

目前国内测定自然环境中厌氧氨氧化反应速率的案例较少。国内有研究者向厌氧氨氧化活性污泥中加入NH₄⁺、NO₂^-和微量元素进行恒温水浴摇床培养，用氮气吹脱污泥30min后开始实验。取样时，停止摇床摇动使污泥沉降，通入氮气使上清液排出。实验过程中每一小时取样测试，通过测定各个时刻上清液中的基质浓度，绘制基质浓度变化曲线求出最大斜率即为最大厌氧氨氧化速率。由于NH₄⁺和NO₂^-的浓度变化受其他因素如反硝化等的影响，所以此方法测定的厌氧氨氧化反应速率不准确，且不能反应厌氧氨氧化在脱氮过程中的贡献。同位素示踪技术可以将厌氧氨氧化和反硝化反应区分开来，分别测得两者速率，该思路已在海洋沉积物和水相厌氧氨氧化研究中得到初步应用。该方法主要思路如下：

反硝化反应是传统硝化-反硝化过程的一部分，在缺/厌氧条件下进行，4个中间过程由硝氮还原酶(NAR)、亚硝氮还原酶(NIR)、一氧化氮还原酶(NO)和氧化亚氮还原酶(NOS)分别催化完成。反应过程如式(1)所示：

厌氧氨氧化是以氨氮和亚硝氮分别作为电子供体和受体，由自养的厌氧氨氧化菌在厌氧条件下直接生成氮气的过程，羟胺和联肼是主要中间产物。具体反应过程见式(2)：

由反应过程公式可以看出，在缺氧或厌氧的环境下，反硝化反应和厌氧氨氧化反应均产生氮气，但是机理存在差异。反硝化反应由硝氮经一系列中间反应产生氮气，氮气的两个氮原子均来自于NO^3-。厌氧氨氧化反应由氨氮和亚硝氮分别作为电子供体和受体产生氮气，氮气分子是由NH₄⁺和NO₂^-各提供一个氮原子组成的。当进行¹⁵N同位素的示踪时，反硝化反应和厌氧氨氧化反应的差异会通过产生氮气中²⁸N₂、²⁹N₂和³⁰N₂的组成得以体现。通过计算得到反硝化与厌氧氨氧化各自产生的氮气量，反硝化及厌氧氨氧化速率通过各自氮气产生量对时间的回归获得。

同位素示踪技术应用于自然生态系统中厌氧氨氧化反应速率的测定准确可靠，并能将厌氧氨氧化反应与反硝化反应区分，从而显现厌氧氨氧化反应在生物脱氮过程中贡献，为厌氧氨氧化反应这个发现的研究提供了简单可行的方法。但由于海洋沉积物与水体沉积物、土壤性质在有机质含量、硝酸盐含量等方面具有较大差异，故该方法不适于直接应用到水体沉积物和土壤厌氧氨氧化反应速率的测定中。对现有测定厌氧氨氧化反应速率的方法作科学的改进，将更适用于水体沉积物、土壤厌氧氨氧化反应速率的测定，同时提高测定效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测水体沉积物和/或土壤中厌氧氨氧化反应速率的方法，为探究厌氧氨氧化反应在自然界生物脱氮过程中的贡献提供准确、可行、高效的方法。

本发明提供的一种检测水体沉积物和/或土壤中厌氧氨氧化反应速率的方法，包括如下步骤：

(1)将待检测样品在无氧条件下进行培养后得到预处理样品；将所述预处理样品分成三部分，分别为预处理样品a、预处理样品b和预处理样品c；