[发明专利]一种从发酵液中提取多粘菌素B的方法

说明书

技术领域

本发明属从生物中提取物质方法领域，特别涉及一种从多粘菌素B发酵液中提取多粘菌素B的方法。

背景技术

多粘菌素B是由多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)在代谢过程中合成和分泌的具有良好抗菌活性的碱性环状多肽，分子量约为1200Da；多粘菌素B在药物上常用其硫酸盐，分子量约为1300Da。目前在已知的抗生素中，多粘菌素对革兰氏阴性菌的作用最强，特别是它能抑制由绿脓杆菌和大肠杆菌引起的各种感染，如脑膜炎、痢疾、呼吸系统感染、腹膜炎、胆管感染、尿路感染、烧伤感染、眼角膜感染及败血症等，且不易产生耐药性。

多粘菌素B可由多粘芽孢杆菌经发酵生产所获得的发酵液，经分离、提取、纯化、干燥而得。在大规模生产过程中其分离、提取、纯化制备一直是一个棘手的问题。至今，国内多粘菌素B的生产水平相对较低，还没有企业正式投产，其原料药基本从国外进口。多粘菌素B纯品的效价为10000IU/g，市场上进口分装的多粘菌素B效价≥6500IU/g，纯度为60～80％左右。

目前多粘菌素B制备工艺主要为吸附分离法和树脂分离法。

美国专利2695261^[1]公布了一种用吸附法从多粘芽孢杆菌的发酵液中提取多粘菌素A、B和E的方法。具体地公布了采用酸化、活性炭吸附、解吸以及干燥的方法，从发酵液中提取多粘菌素A、B和E。WIPO专利058427^[2]同样采用吸附法，具体地公布了采用活性炭吸附、透析、有机溶剂沉降以及冷冻干燥的方法，从发酵液中提取多粘菌素B。这两种工艺采用活性炭吸附，单步损失较大，且发酵液中的杂质容易造成活性炭的不可逆吸附，使活性炭难以再生重复使用；透析、冻干等操作对设备要求高，较萃取法耗时长，成本高，不适合工业化生产放大。

美国专利3132994^[3]公布了一种用树脂分离法从多粘芽孢杆菌的发酵液中提取多粘菌素的方法。具体地公布了用离子交换树脂吸附、洗脱以及调pH沉淀的方法从发酵液中提取多粘菌素。WIPO专利142611^[4]同样用到了树脂分离法，具体地公布了用活性炭脱色、树脂吸附、洗脱以及沉淀的方法，从多粘芽孢杆菌的发酵液中提取多粘菌素B。这两种工艺一次性投入较大，而且树脂容易污染，需要再生处理。因此，树脂分离法较萃取法操作更为繁琐，而且制备的多粘菌素B纯度较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从多粘菌素B的发酵液中提取多粘菌素B的方法，以较高的收率制备得到高纯度硫酸多粘菌素B。该方法操作简便、耗时短、对设备要求低。

本发明的技术方案是：一种从多粘菌素B的发酵液中提取多粘菌素B的方法，包括以下步骤：

a.将多粘菌素B的发酵液固液分离，取滤液；

b.将步骤a所得的滤液用极性有机溶剂萃取，萃取液在pH1.0～2.0用水反萃；和

c.将步骤b所得的反萃液中加入反萃液体积3～8％(w/v)的无机盐，并调整至pH 9.0～10.0，从而析出沉淀，即为多粘菌素B。

本发明中步骤a为：将多粘菌素B的发酵液经固液分离，取滤液。其中所述的多粘菌素B的发酵液是任何已知的含有多粘菌素B的菌体发酵液。一般是多粘芽孢杆菌发酵液。发酵液固液分离的方法是已知的任何方法，如过滤法、离心分离法、静置沉淀法等。本发明优选过滤法。因为发酵液本身黏度较大，为了便于发酵液的大规模固液分离，优选的将发酵液经过预处理，再进行固液分离。所述的预处理优选包括调节发酵液pH至2.0～3.0，80～100℃加热25～60分钟。

本发明中步骤b为：将步骤a所得的滤液用极性有机溶剂进行萃取，然后将萃取液在pH1.0～2.0用水反萃。其中，萃取和反萃的方法都是常规方法。萃取所用的极性有机溶剂优先选自C4～C8的烷基醇和烷基醇与烷基酸所形成的C4～C8的酯。更佳的选自正丁醇、正丙醇、正戊醇、乙酸乙酯和乙酸丁酯，最优选正丁醇。极性有机溶剂在萃取时的加入量是常规的萃取体积，优选滤液体积的40～60％(体积百分比)。极性有机溶剂萃取较佳的在pH 11.0～12.5下进行。用水反萃时水的用量是常规的反萃用量，优选萃取液体积的90～110％(体积百分比)。

较佳的步骤b中极性有机溶剂萃取液在用水反萃前还经过了用水洗涤的步骤。用水洗涤的方法是常规的萃取液水洗方法，一般如加入水混合均匀后，弃水相即可。水洗对水的用量没有要求。水洗可以反复进行多次。