[发明专利]一种小黑杨花粉植株转基因方法

权利要求书

1.一种小黑杨花粉植株转基因方法，其特征在于小黑杨花粉植株转基因方法，按以下步骤进行：一、取抽茎培养基中培养的高度为1～2cm的无根苗，移入生根培养基中诱导生根，待苗长到5～8cm时，取苗上2～3cm的顶端移入生根培养基中进行二次生根，选取苗高4～5cm的二次生根后的植株作为外植体；二、取步骤一的外植体上长度为1～3cm的新生的叶片，在叶片基部和叶片中间各切一刀，弃掉叶尖儿部位，接种于分化培养基上进行预培养2～3d；三、挑取携带外源基因的农杆菌EHA105接种到含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB培养基中培养16～24h，培养温度为28℃，摇床转速为220r/min，得菌液，向菌液中加入含有50mg/L卡那霉素的LB培养基使菌液稀释100倍，然后在28℃、220r/min转速下培养至菌液的OD值达到0.4～0.6，然后用无菌水将OD值为0.4～0.6的菌液稀释到OD值为0.1～0.2；将步骤二中预培养后的叶片放入OD值为0.1～0.2的菌液中浸泡5～10min，然后取出叶片用无菌滤纸吸去多余菌液；四、然后将叶片接种在分化培养基上，在25℃暗培养条件下培养1～2d；五、取出叶片，放在无菌吸水纸上将水分吸干，然后将叶片移至选择培养基中培养5～10d，产生愈伤组织，将愈伤组织切下放入新的选择培养基中，培养15～20d后产生抗性芽，即完成小黑杨花粉植株转基因方法；其中步骤一所述抽茎培养基为含有0.1mg/L NAA和0.2mg/L 6-BA的MH培养基；步骤一所述生根培养基为含有0.2mg/L IBA的MH培养基；步骤二和步骤四所述的分化培养基为含有0.1mg/LNAA和0.5mg/L 6-BA的MS培养基；步骤五所述的选择培养基为含有0.1mg/L NAA、0.5mg/L 6-BA、40mg/L卡那霉素和300mg/L头孢噻肟钠的MS培养基。

2.根据权利要求1所述的一种小黑杨花粉植株转基因方法，其特征在于步骤二中取步骤一的外植体上长度为2cm的新生的叶片。

3.根据权利要求1或2所述的一种小黑杨花粉植株转基因方法，其特征在于步骤三所述携带外源基因的农杆菌EHA105中的外源基因为毛果杨AP2基因或柽柳bZIP基因。

4.根据权利要求3所述的一种小黑杨花粉植株转基因方法，其特征在于挑取携带外源基因的农杆菌EHA105接种到含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB培养基中培养18～22h。

5.根据权利要求4所述的一种小黑杨花粉植株转基因方法，其特征在于步骤三中在28℃、220r/min转速下培养至菌液的OD值达到0.5。

6.根据权利要求5所述的一种小黑杨花粉植株转基因方法，其特征在于步骤三中浸泡8min。

7.根据权利要求6所述的一种小黑杨花粉植株转基因方法，其特征在于步骤五中将叶片移至选择培养基中培养6～9d。

8.根据权利要求6所述的一种小黑杨花粉植株转基因方法，其特征在于步骤五中将叶片移至选择培养基中培养7～8d。

9.根据权利要求7所述的一种小黑杨花粉植株转基因方法，其特征在于步骤五中将愈伤组织切下放入新的选择培养基中，培养16～19d后产生抗性芽。

10.根据权利要求7所述的一种小黑杨花粉植株转基因方法，其特征在于步骤五中将愈伤组织切下放入新的选择培养基中，培养17～18d后产生抗性芽。