[发明专利]一种安全性慢病毒载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种安全性慢病毒载体及其应用。

背景技术

β地中海贫血(简称β地贫)是一类由于血红蛋白(HbA)生成障碍导致的遗传性疾病。HbA生成过程中βHb合成受到抑制，破坏了血红蛋白两类亚基的平衡状态，相对过剩的αHb在红细胞内产生毒性沉积导致溶血性贫血。针对β地贫的发病环节，王宝斌等构建了可专一性地结合游离αHb的α血红蛋白稳定蛋白(AHSP)基因表达载体并将其导入β654地贫小鼠体内，以期阻止过剩的αHb产生毒性沉积。通过分子生物学、生物化学、病理学和血液学等技术手段检测小鼠后发现其地贫表型有所改善(Transgenic Humanα-Hemoglobin Stabilizing Protein Could PartiallyRelieve β^IVS-2-654-Thalassemia Syndrome in Model Mice.Human Gene Therapy.201 0 February，21(2)：149-156.)。

这是一个利用慢病毒介导方式治疗血液性疾病的成功范例。但是要将该慢病毒载体真正用于临床治疗，还需要解决一些安全性的问题。①尽管人们已经花了大量精力使慢病毒载体很安全(最低限度保留了约5％的原HIV序列，使之难以形成重组相适应性病毒)，但仍不能保证残留的序列不会对人体产生危害。②HIV具有强有力polyA断裂加尾功能，但是经过删减后的ΔU3的慢病毒载体却会出现“通读”(Readthrough)，转录下游基因，造成安全隐患(Anne-Kathrin Zaiss et al.，(2002).RNA 3’Readthrough ofOncoretrovirus and Lentivirus：Implications for Vector Safety and Efficacy.Journal of Virology.July；76(14)：7209-19.)。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对目前的慢病毒载体具有安全隐患的不足，提供一种安全性高的慢病毒载体。

本发明的解决上述技术问题的技术方案如下。

本发明的技术方案之一是：一种安全性慢病毒载体，该慢病毒载体携带了整合酶Cre基因表达盒，并且在3’LTR的U3区含有LoxP位点序列，在U3区中并在LoxP位点的下游含有用于导入外源基因的限制性酶切位点。

其中，整合酶Cre表达盒在慢病毒载体的位置是任何位置，只要不影响慢病毒载体的其他功能即可。较佳的如在慢病毒载体FUGW中为原GFP(荧光蛋白)的位置，将原GFP基因替换为整合酶Cre基因，仍然使用原来的表达元件即可。所述的整合酶Cre基因是常规的，较佳的其序列如SEQID NO：2所示。LoxP在U3区的位置可以是任何位置，较佳的是U3区的两个EcoRV酶切位点之间。所述的LoxP位点序列是常规的，较佳的其序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

优选的，本发明的安全性慢病毒载体进一步在3’LTR的U3区含有cHS4的400bp核心序列和SV40的2×USE两种元件中的任何一种或两种。这可以使载体的通读率下降。

本发明中，所含片段优选反向接入的cHS4元件和/或正向接入的2×USE元件。更优选反向接入的cHS4元件和正向接入的2×USE元件叠加。最优选5’方向至3’方向依次是反向接入的cHS4元件和正向接入的2×USE元件。cHS4反向和2×USE正向相连接入到3’LTR的U3区两个EcoRV位点之间，通读率降低效果最为明显。

本发明中，所述的cHS4的400bp核心序列为常规，较佳的是序列表中SEQ ID NO：3所示的序列。所述的SV40的2×USE是指2个串联的USE元件，为常规，较佳的是序列表中SEQ ID NO：4所示的序列。

本发明中，所述的cHS4的400bp核心序列和/或SV40的2×USE在U3区的位置可以是任何位置，较佳的是在U3区中并在LoxP位点序列的下游。

本发明中，所述的慢病毒载体可以是现有的任何慢病毒载体，较佳的是慢病毒载体FUGW。本发明的方法对所有3’LTR都有作用，对FUGW的3’LTR效果最佳。