[发明专利]构建血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落ITS文库的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种构建血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落ITS文库的方法。

背景技术

血红铆钉菇(Chroogomphis rutillus)，担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，铆钉菇科，红铆钉菇属，俗称红蘑、松树伞、松蘑、肉蘑，形状似铆钉，颜色为暗红色，名贵野生菌根食用菌，是针叶树木重要的外生大型菌根真菌，夏、秋季群生或散生。该菇肉厚、品质滑润、细腻，味道鲜美，营养价值高，富含蛋白质，含有人体所需的8种必需氨基酸、钙、铁等矿物质和大量碳水化合物，也是膳食纤维和天然抗氧化物的重要来源，深受人们喜爱。

血红铆钉菇为外生菌根菌，至今难以人工驯化。近年来随着旅游业的发展和高强度的采收，血红铆钉菇与卫生资源与生存环境正在受到威胁和破坏。为了更好地保护血红铆钉菇资源，许多研究者致力于血红铆钉菇的人工驯化研究，如利用生长环境中的土壤或者松树的组织培养物作为血红铆钉菇菌丝体分离的培养基。到目前为止，虽然纯培养的菌丝已经获得，但是血红铆钉菇的人工驯化仍未成功。一些研究者开始从生态角度研究血红铆钉菇生长环境中的影响因子，如植被种类、光照、水分等条件。但其生长环境中的微生物种群的研究未见报道。

迄今为止，仍然有99％的微生物是未知的，并且绝大多数的微生物种类是不可培养的，基于分子生物学技术的对不可培养微生物种类的鉴定加速了对环境样品的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落ITS文库的方法。

本发明提供了一种构建血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落的分子图谱的方法，包括如下步骤：

(1)取血红铆钉菇子实体周围土壤，作为土壤样本提取宏基因组DNA；

(2)以所述宏基因组DNA为模板，用上游引物ITS1和下游引物ITS4组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物，即为DNA片段库(690-710bp)；所述上游引物ITS1为序列表的序列1所示的DNA片段；所述下游引物ITS4为序列表的序列2所示的DNA片段；

(3)将所述DNA片段库与pMD19-T载体连接，得到重组质粒库；

(4)分别以所述重组质粒库中的每个重组质粒为模板，用上游引物RV-M和下游引物M13-47组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物；将各个PCR扩增产物分别用限制性内切酶Hinf I、Hae III、Msp I、Taq I和Mbo I进行酶切并电泳，得到分子图谱；所述上游引物RV-M为序列表的序列3所示的DNA片段；所述下游引物M13-47为序列表的序列4所示的DNA片段。

所述步骤(2)中，所述PCR扩增的反应体系由溶剂和溶质组成；所述溶剂为1×Ex Taq Buffer；每50μl所述反应体系中含有如下溶质：20ng所述模板、80pmol所述上游引物、80pmol所述下游引物、0.2mmol/l dNTP和1.5U Ex Taq DNA聚合酶。

所述步骤(2)中，所述PCR扩增的反应程序为：95℃5min；95℃30s、58℃1min、72℃30s，30个循环；72℃10min。

所述步骤(4)中，所述PCR扩增的反应体系由溶剂和溶质组成；所述溶剂为1×Ex Taq Buffer；每50μl所述反应体系中含有如下溶质：20ng所述模板、80pmol所述上游引物、80pmol所述下游引物、0.2mmol/l dNTP和1.5U Ex Taq DNA聚合酶；

所述步骤(4)中，所述PCR扩增的反应程序为：95℃5min；95℃30s、58℃1min、72℃30s，30个循环；72℃10min。

所述步骤(4)中，所述电泳可为2％琼脂糖凝胶电泳。所述电泳的参数优选为：100V电压、40mA电流、3-4小时(如3.5小时)。

所述步骤(1)中，所述提取宏基因组DNA的方法包括如下步骤：

(1)将所述土壤样本悬浮于缓冲液，12000rpm离心10min，取沉淀；

(2)洗涤步骤(1)的沉淀；

(3)将步骤(2)的沉淀进行宏基因组的提取。

所述提取宏基因组DNA的方法具体可为：

(1)将5g所述土壤样本悬浮于3ml TENP缓冲液后涡旋震荡10min，12000rpm离心10min，取沉淀；

(2)将步骤(1)的沉淀用TENP缓冲液洗涤三次，然后用PBS缓冲液洗涤1次；