[发明专利]一种改良的人血中抗体的检测技术

说明书

技术领域

本发明属于检测技术领域，涉及抗体的检测技术。

背景技术

目前流行的基于表位多肽抗原的血液中IgA、IgG及IgM抗体的检测方法：

1、抗原的溶解与包被：溶解可溶性抗原，根据不同抗原确定不同稀释倍数，稀释后酶标板每孔加入50-100ul抗原包被液，4℃静置过夜。稀释液：碳酸盐缓冲液，pH 9.6或PBS缓冲液，pH 7.4。

2、封闭：弃去包被液，洗板机或手动洗涤3-6次。洗涤液：PBST(PBS缓冲液包含0.05％Tween 20)。每孔100-200ul封闭缓冲液封闭过量的结合部位。

3、血清或血浆中抗体的孵育：弃去封闭缓冲液，洗板机或手动洗涤3-6次，每孔加入100μl封闭缓冲液稀释的血清或血浆(1∶100-500)，37℃或室温孵育1-4小时。

4、酶标抗体的孵育：弃去孵育的血清或血浆，洗板机或手动洗涤3-6次，根据检测抗体类型选择酶标抗体，常用辣根过氧化物酶标记的羊抗人抗体，每孔加入100-200μl，1/10000-30000封闭缓冲液稀释的酶标抗体，37℃或室温孵育1-4小时。

5、显色：弃去酶标抗体，洗板机或手动洗涤3-6次，每孔加TMB显色液100μl，显色15-30min，加终止液每孔50μl，以450nm为测试波长，630nm为参考波长，测定酶标板每孔OD值。

世界卫生组织专家组提出对ELISA的评价认为：“ELISA作为蛋白定量检测是一个好办法，但要做好它不容易。”虽然ELISA在国内外已使用得非常广泛，但对该法在应用中的评价尚不一致，过去在ELISA开始建立时有全面肯定的趋势，而在广泛研究和实践中发现了一些缺点，特别对ELISA的非特异性评价的资料不够完善，因此对出现一些非特异性反应的时候，往往不易解释，遇到了一些困难，如存在重演性问题，特异性问题以及能否考核疗效问题等等。因此，还需进一步研究改进，加以完善。

发明内容

本发明要解决的技术问题是公开一种改良的人血中抗体的检测技术，从而提高了人血中抗体检测的准确度、灵敏度。

本发明提供一种改良的基于表位多肽抗原的血液中IgA、IgG及IgM抗体的检测方法，由以下步骤完成：

1、多肽抗原的设计与合成：

①特异多肽抗原的合成：根据所选蛋白的核心表位，设计并合成特异多肽抗原；

②内参多肽抗原的合成：本发明提供一种与人类蛋白组无免疫交叉反应的羊多肽序列：H-VFQKLKDLKDYGGVSLPEWVCIAFHTSG-OH，为内参多肽抗原；

2、特异和内参多肽抗原的溶解：将中性及碱性多肽抗原溶解于67％乙酸中，浓度5mg/ml，作为储备液，分装后置于-20℃冰箱保存；

3、特异和内参多肽抗原的包被：

①特异多肽抗原包被：包被液稀释特异多肽抗原至所需浓度，每孔加100μl多肽抗原包被液，3复孔重复，覆封板膜，4℃静置过夜；

②内参多肽抗原包被：包被液将内参多肽抗原稀释至10-20μg/ml浓度，每孔加100μl，对应特异多肽抗原3复孔重复；

其中特异多肽抗原包被浓度应以质控血样(Quality control，QC)的特异结合指数(specific binding index，SBI)为参照标准，质控血样的特异结合指数参照标准范围在1-1.4之间；

所述的质控血样(Quality control，QC)的制备为100-1000健康人血清或血浆的混合样本，分装20μl/管，-20℃保存。长期保存应置于-80℃冰箱中；

所述的包被液配方为：叠氮钠NaN₃ 0.1g，加PBS缓冲液至100ml；

举例说明酶标板多肽抗原包被设计：