[发明专利]一种测定β-葡聚糖合成酶活力的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是酶学与酶技术领域，具体涉及一种测定β-葡聚糖合成酶活力的方法。

背景技术

β-葡聚糖是一类非淀粉类多糖，它是由β-1，3-葡萄糖苷键和/或β-1，6-葡萄糖苷键以及少量的β-1，4-葡萄糖苷键组成的链状多糖，是真菌和植物细胞壁的重要组成成分。大量的化学和药理分析表明，富含β-葡聚糖的真菌多糖(如灰树花多糖、香菇多糖)具有明显的抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、调节血糖、降血压等作用。β-葡聚糖合成酶对β-葡聚糖的合成具有至关重要的作用。目前，该酶活力的检测方法中大都是以UDP-[¹⁴C]葡萄糖为底物，通过使用液体闪烁计数仪测定UDP-[¹⁴C]葡萄糖的放射活性的变化来测定β-葡聚糖合成酶的活力，这类方法需要昂贵的底物(UDP-[¹⁴C]葡萄糖)和检测仪器，实验成本高，而且放射性底物UDP-[¹⁴C]葡萄糖具有明显的危害性，所以这类方法很难被广泛应用。

本发明以葡萄糖为底物、用3，5-二硝基水杨酸作为显色剂来测定β-葡聚糖合成酶的活力。该方法不受磷酸盐缓冲液的干扰，所得酶浓度曲线与酶促反应速度在较宽的酶浓度范围内呈线性相关。该法不需要昂贵的仪器，大大节省了实验成本，而且该方法使用不含有放射性的葡萄糖作为底物，安全性高，便于大规模推广应用。

发明内容

针对已有技术的缺点，本发明提供一种测定β-葡聚糖合成酶活力的方法，该方法以葡萄糖为底物、用3，5-二硝基水杨酸作为显色剂来测定β-葡聚糖合成酶的活力。该方法与使用UDP-[¹⁴C]葡萄糖为底物、通过使用液体闪烁计数仪测定UDP-[¹⁴C]葡萄糖的放射活性的变化来测定β-葡聚糖合成酶的活力的方法相比，可以大大降低实验成本，而且该方法使用不含有放射性的葡萄糖作为底物，实验的安全性高。本方法灵敏度高，操作简单安全，方便快捷。

该测定β-葡聚糖合成酶活力的方法包括以下工艺步骤：

(1)制样——β-葡聚糖合成酶溶液的制备

准确称取1.0-5.0g β-葡聚糖合成酶，加入50-100ml 7.0mmol/L NaH₂PO₄，7.0mmol/L Na₂HPO₄，pH＝6.8的磷酸盐缓冲液搅拌使其溶解，样品的最终浓度为0.01g/ml-0.1g/ml，4℃保存备用；

(2)葡萄糖标准溶液的配制

精确称取100mg无水葡萄糖，加蒸馏水定容至100ml，得到浓度为1.0mg/ml的葡萄糖标准溶液；

(3)DNS溶液的配制

称取3，5-二硝基水杨酸3.15g，加水500ml，搅拌溶解，水浴至45℃；然后逐步加入100ml 0.2g/ml的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明；再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g；继续45℃水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解，停止加热；冷却至室温后，用蒸馏水定容至1000ml，过滤，取滤液，储存于棕色瓶中，避光保存；室温下存放7d后可以使用，有效期为6个月；

(4)葡萄糖溶液标准曲线的制作

分别取6-15组具有不同浓度的葡萄糖标准溶液2.0ml，浓度范围在0-500μg/ml之间，加入DNS试剂1.5ml，沸水浴加热5-20min，取出冷却，加入蒸馏水定容至25ml后于波长510-570nm处测定光密度值；每个浓度做三个平行样；以上加量可按比例增减；根据每组葡萄糖浓度与测得的光密度值之间的关系，以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线；

(5)β-葡聚糖合成酶的活力单位

β-葡聚糖合成酶的活力单位(U)被定义为：每分钟消耗1μg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位；比活力(U/mg)定义为单位酶蛋白(1mg)具有的酶活力单位；

(6)β-葡聚糖合成酶的比活力的计算

β-葡聚糖合成酶的比活力计算公式：

X＝W/(T×M)

式中：X——酶的比活力，单位，U/mg；

      W——反应掉的葡萄糖的质量，μg；

      T——反应时间，min；

      M——待测样品的质量，mg或待测样品的体积，ml；

(7)β-葡聚糖合成酶活力的测定