[发明专利]H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种能够在Vero细胞中稳定增殖的细胞株及其应用，特别涉及一种H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株及其应用。属于疫苗制备领域。 

背景技术

禽流行性感冒(简称禽流感，AI)是由A型流感病毒引起的禽类的感染和/或疾病综合症。引起AI的病原称为禽流感病毒。 

根据世界动物卫生组织(OIE)的疾病分类标准，高致病性禽流感属A类疾病，我国也将其列为一类传染病，其传播速度快、发病率和死亡率高；而中等到低等毒力的AIV可引起亚临床症状，出现产蛋下降、呼吸系统或全身性感染等多种程度不同的各种症状。鸡群感染该病毒，严重影响鸡的生产性能。肉仔鸡增重减慢，死亡数量增加，易继发患其它细菌性疾病。H9N2亚型AIV是一种低等毒力的病毒，可引起临床或亚临床症状。目前，在全世界从各种家禽和野生禽中分离到上千株H9N2亚型AIV，90年代以来，在世界许多国家发生；自1998年，国内许多鸡群发生H9N2亚型禽流感的报道，H9N2亚型AIV在我国广泛存在，并且多呈低致病性感染，然而由于其分布广泛并且有逐渐蔓延之势，因此给养禽业造成的威胁是巨大的。 

预防该病最行之有效的办法就是疫苗的接种，目前，市售的禽流感疫苗绝大多数为鸡胚组织苗，相对于细胞苗而言，其具有成本高、产品质量批间差大、且容易生产鸡源性潜在疾病的感染等缺点。近几年，随着禽流感的频繁暴发以及跨种属传播，需要一种可在流感大流行时能够替代鸡胚快速、大量生产流感病毒的细胞培养系统。 

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种能够在Vero细胞中稳定增殖的H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株。 

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术手段实现的： 

2011年初，本发明人从黑龙江省双城市郊某养殖场分离得到一株禽流感病毒(H9亚型)病毒株，其具有经胰酶处理后能在细胞上增殖的特性，基于此，本研究针对组织苗的不足，HY株的特性，将其驯化为一株能够在Vero细胞上良好增殖的VERO细胞适应株，并将其命名为H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株AIV HY株，其具有经胰酶处理后能在细胞上增殖的特性，可用于在Vero传代细胞中增殖进而制备禽流感病毒灭活疫苗。 

所述的H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株AIV HY株，分类命名为禽流感病毒(H9亚型)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC 5409，保藏日期为2011年10月28日。 

本发明的H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株AIV HY株是通过以下方法制备得到的： 

1病毒的分离 

病料来自黑龙江省双城市郊某养殖场，采集濒死鸡气管拭子和泄殖腔拭子，用2000单位青、链霉素溶液中处理后，接种鸡胚，收集48h～78h鸡胚尿囊液。对收获的鸡胚液进行血凝试验，HA血凝价为9log2。 

2病毒分离株血凝抑制(HI)试验 

分别用H5、H7和H9亚型AI标准阳性血清及ND、EDS-76病毒标准阳性血清与HA为阳性的鸡胚尿囊液进行HI试验。结果表明，与H5、H7、ND和EDS-76病毒标准阳性血清反应为阴性，与H9亚型AI标准阳性血清反应为阳性。 

3在Vero细胞的传代与收获 

3.1将收获的组织毒，用灭菌生理盐水稀释后，接种80％长成单层后的Vero细胞，37℃培养3天，放入-20℃中冻融3次，收获病毒液。 

3.2重复上述试验10次，直至病毒在Vero细胞增值良好。 

本发明的H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株AIV HY株可用于制备H9亚型禽流感病毒病毒液，其病毒增殖速度和产量上都优于目前鸡胚培养的禽流感病毒，以及未驯化的H9亚型禽流感病毒病毒株。 

将本发明的H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株AIV HY株用于制备H9亚型禽流感灭活疫苗，具有广泛的应用前景。 

本发明一种疫苗组合物，其特征在于含有本发明所述的H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株。所述的疫苗组合物，其特征在于还可进一步包含药学上接受的载体或佐剂。 

通过比较实验发现，利用本发明的VERO细胞适应株AIV HY株生产疫苗新方法与利用鸡胚生产的老方法的比较，具有以下优点： 

1、维持液中加入的胰蛋白酶是经过壳聚糖包被后，起到缓慢释放的作用； 

2、细胞苗在增殖速度和产量上都优于目前鸡胚培养的禽流感疫苗；