[发明专利]一种利用Vero传代细胞制备禽流感病毒及其灭活疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种灭活疫苗的制备方法，特别涉及一种利用VERO传代细胞制备禽流感病毒灭活疫苗的方法。本发明属于畜牧兽医技术领域。 

背景技术

禽流感是目前危害世界养禽业发展的重要疾病，特别是高致病性禽流感的暴发，给养禽业带来了毁灭性的灾难。2004年至今，中国内地相继暴发高致病性禽流感，不仅沉重打击了国内的养禽业，而且对我国的经济和贸易发展也造成了严重的影响。 

自1933年鸡胚培养流感病毒获得成功以来，鸡胚就成了人们大量获得流感病毒的主要来源。但用鸡胚分离流感病毒或传代易引起病毒变异，而且鸡胚残留物还可引起过敏性反应。鸡胚作为疫苗生产基质，还存在大规模生产时供给和潜在外源病毒污染问题。近几年，随着禽流感的频繁暴发以及跨种属传播，需要一种可在流感大流行时能够替代鸡胚快速、大量生产流感病毒的细胞培养系统。本研究应用Vero细胞系培养流感病毒解决了鸡胚蛋白遗留物和外源病毒污染的问题，且培养的病毒免疫原性更稳定。 

流感病毒只有当其血凝素(HA)为裂解状态时其病毒颗粒才具感染性，HA能否被蛋白酶裂解为HA1和HA2是病毒感染细胞的先决条件。但流感病毒本身不具有裂解HA的蛋白酶，而由宿主细胞的蛋白酶作用下裂解HA，由于VERO细胞不具有HA的蛋白酶所以对HA不具有裂解能力。维持液中添加适量的胰酶，能补充细胞中蛋白酶的不足，增加了HA的裂解量，增强了流感病毒感染力，流感病毒在传代细胞系中的复制可因培养液中的胰蛋白酶的快速失活而受到影响，同时胰蛋白酶抑制剂的积累也是影响胰蛋白酶活性的另一个原因。为了避免胰蛋白酶在维持液中被抑制剂作用后失活而影响HA的裂解，本研究室采用壳聚糖对胰酶进行包被后，加入到细胞维持液中，使胰酶在维持液中缓慢释放，克服了在病毒繁殖过程中由于胰酶的失活而影响血凝素的裂解。也避免了多次加入胰酶而对细胞造成污染的几率。培养出的 病毒滴度高，稳定性好，适合进行大量的疫苗生产。禽流感传代细胞疫苗的研制将为我国禽流感细胞型疫苗生产提供新的思路，该疫苗株以细胞为载体，除了在增殖速度和产量上都优于目前鸡胚培养型禽流感疫苗株外，在生产疫苗的价格上也有巨大的市场优势。除此之外，利用鸡胚生产流感疫苗，在处理使用后的鸡胚残体上只能采用焚烧的办法，既增加成本，又污染环境，而利用细胞生产疫苗则摆脱了对鸡胚依赖，没有处理鸡胚残体这一环节。可以说利用传代细胞来生产禽流感疫苗既经济又环保。本试验的结果证明，流感病毒可在VERO细胞中快速繁殖，具备生产流感疫苗的潜力。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的不足，提供一种利用Vero传代细胞生产禽流感病毒及其灭活疫苗的方法。 

本发明的一种利用Vero传代细胞生产禽流感病毒液的方法，其特征在于首先采用壳聚糖对胰酶进行包被，得到包埋胰酶的壳聚糖纳米粒；然后将包埋胰酶的壳聚糖纳米粒加入到Vero传代细胞的细胞培养液中，继而接种病毒进行病毒培养，收获病毒液，即得。 

本发明一种利用Vero传代细胞制备禽流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于由以上所述的方法制备得到的病毒液按照制备灭活疫苗的常规方法制备。 

优选的，本发明的一种利用Vero传代细胞生产禽流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，具体的，包括以下步骤： 

(1)制备包埋胰酶的壳聚糖纳米粒； 

(2)接种：取病毒种毒，用灭菌生理盐水稀释10^-5～10^-7倍，待Vero传代细胞80％长成单层后，弃掉细胞培养液，按培养液体积的1/10接入稀释后的病毒液，37℃吸附1小时，加入维持液，在维持液中加入步骤(1)中得到的包埋胰酶的壳聚糖纳米粒，37℃培养3天，收获病毒液； 

(3)病毒液收获：收获病毒液，分装，放入-20℃冰柜中反复冻融3次，测定每个分装容器中病毒的HA效价，HA效价低于1∶128者弃去；同时作无菌检验应无菌生长，收获的病毒液灭活前在2～8℃保存； 

(4)病毒液灭活：将病毒液注入灭活灌，开启灭活罐的搅拌器，准确量取10％的甲醛溶液，在不断搅拌时加入至含抗原液的灭活灌中，使其充分搅拌均匀；甲醛 溶液终浓度为0.1％；将灭活罐升温至37℃，维持灭活时间16小时，期间不停缓慢搅拌，灭活结束后，做灭活检验和无菌检验，灭活后的病毒液在2-8℃保存； 

(5)制备灭活疫苗：将步骤(4)中制备得到的病毒灭火液加入佐剂制备成灭活疫苗。 

作为参考，本发明具体实施例中包埋胰酶的壳聚糖纳米粒按照以下方法制备得到：