[发明专利]利用核酸外切酶的3’-5’外切酶活性克隆目的DNA的方法无效
| 申请号： | 201110393988.9 | 申请日： | 2011-12-01 |
| 公开（公告）号： | CN102443596A | 公开（公告）日： | 2012-05-09 |
| 发明（设计）人： | 刘斌;李宏宇;林辰涛 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院作物科学研究所 |
| 主分类号： | C12N15/66 | 分类号： | C12N15/66;C12R1/19 |
| 代理公司： | 北京路浩知识产权代理有限公司 11002 | 代理人： | 王朋飞;王加岭 |
| 地址： | 100081 北*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 利用 核酸外切酶 外切 活性 克隆 目的 dna 方法 | ||
1.一种利用核酸外切酶的3’-5’外切酶活性克隆目的DNA的方法，其特征在于，向含有线性载体和目的DNA片段的体系中加入具有3’-5’外切酶活性的核酸外切酶，在冰上消化30sec～3min，使两者产生具有同源序列的5’末端，然后在70～75℃下使酶失活，最后退火使线性载体和目的DNA片段重组形成带有缺刻的环形质粒，并转化到大肠杆菌中修复缺刻并随宿主基因组进行复制。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，目的DNA片段的两端带有与线性载体两端同源的10～35个碱基。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，目的DNA片段的两端带有与线性载体两端同源的15个碱基。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，退火温度为(重组区段Tm值-5)℃。
5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，具有3’-5’外切酶活性的核酸外切酶为核酸外切酶III、T4DNA聚合酶、Klenow片段、T7DNA聚合酶。
6.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，冰上消化时间为30sec。
7.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，线性载体和目的DNA片段以5∶1～1∶5的摩尔比混合。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，线性载体和目的DNA片段以2∶1的摩尔比混合。
9.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，加入的核酸外切酶的酶量为5～15个单位/10μL反应体系。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，加入的核酸外切酶的酶量为10个单位/10μL反应体系。
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