[发明专利]一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种橡胶树未授粉胚珠作为外植体，通过体胚发生途径再生橡胶树完整植株的方法，属于细胞工程领域，特别是涉及一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法。

背景技术

巴西橡胶树所产生的胶乳是重要的工业原料和战略物资，在国民经济中占有举足轻重的地位。长期以来，橡胶树的品种选育主要采用常规育种方法，而用于选育种的材料均来自1876年魏克汉（H A Wickhem）系统的后代及其衍生物，不仅育种周期长，且遗传基因非常狭窄，很难培育出即高产抗逆性又强的品种。现在生产上主要使用芽接无性系作为种植材料，而这种种植材料受老态和砧木不良的影响，严重影响橡胶树的产胶量。国内外大量研究证明：幼态橡胶植株比老态芽接苗的茎围增长9%～20%，产量增加20%～50%，抗风、抗寒能力显著增强。而砧木不好会降低产量15%，甚至达到40%。

为了获得产量更高且抗逆性更强的橡胶种植材料，从上世纪50年代以来，橡胶育种学家既开始着手研究其组织培养技术，并取得了一定的进展。通过对高产抗寒品种的花药、子房、未授粉胚珠和内种皮培养，获得的体胚植株被认为是一种高产、高效的新型种植材料。然而，橡胶树的组织培养是木本植物中难度较大的树种之一，且品种之间组培难易也存在较大差异，还有许多高产抗寒无性系未获得成功，难以满足生产中对橡胶树优良品种组培苗的大量需求，同时限制了体胚植株在橡胶树育种及遗传转化研究中的进一步应用。因此，开展对高产抗寒橡胶树品种的组培研究具有十分重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是利用橡胶树未授粉胚珠为外植体，为橡胶选育种及良种繁育提供一种生长快、产量高、抗逆性强的体胚植株再生体系的方法。

本发明提供的一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法包括外植体的选择处理过程、胚性愈伤组织诱导过程、胚状体分化培养过程、植株再生的诱导过程：

1、外植体的选择处理过程：选取优良品种的雌花，花朵呈黄色、未开花前1-2天时为材料，摘下的雌蕊用无菌纱布包好，在超净工作台上用75%的乙醇处理30秒，再用0.1%的升汞消毒10~20分钟，并用镊子不停地搅动，使之彻底灭菌，最后用无菌水冲洗5~6次；

2、胚性愈伤组织诱导过程：用摄子和解剖针剥取雌蕊，取出幼小胚珠接种于诱导胚性愈伤组织的培养基上，进行光照培养，培养温度为26~28℃之间，光照10h·d^-1，光照度约500lx；所述诱导胚性愈伤组织的培养基为MS培养基和附加成分，并将MS培养基中的硝酸胺、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、无水氯化钙的含量调整为硝酸胺1320~1650mg/L、硝酸钾1520~1900 mg/L、磷酸二氢钾130~170 mg/L、七水硫酸镁290~370 mg/L、无水氯化钙260~332 mg/L，并添加KT0.5~2.5 mg/L 、NAA0.5~3.0 mg/L、6-BA0.5~3.0mg/L、2,4-D1.0~3.0mg/L、半胱氨酸100~450 mg/L、PVP500~1500 mg/L、水解乳蛋白30~70 mg/L、葡萄糖200~600 mg/L、椰子水40~80 mg/L、蔗糖50~80g/L、琼脂4~7 g/L；

3、胚状体分化培养过程：将产生的胚性愈伤组织接种于胚状体分化培养基上，进行光照培养20~60天，培养温度为23~27℃之间，光照10h·d^-1，光照度约500lx；所述胚状体分化培养基为MS培养基和附加成分，并将MS培养基中的硝酸胺、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、无水氯化钙的含量调整为硝酸胺1300~1650mg/L、硝酸钾1520~1900 mg/L、磷酸二氢钾130~170 mg/L、七水硫酸镁290~370 mg/L、无水氯化钙260~332 mg/L，并添加KT0.5~2.5 mg/L、NAA0.1~2 .0mg/L、GA₃0.1~1.5 mg/L、蔗糖60~90g/L、琼脂4~7 g/L；