[发明专利]一种高纯度雷莫拉宁的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及到一种从发酵培养物中制备高纯度雷莫拉宁的方法。

背景技术

糖肽类抗生素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(金葡球菌，MRSA)的首选药物。自1959年万古霉素用于临床以来，它一直是治疗革兰氏阳性菌引起严重感染的最有效的药物之一。绝大多数引起临床感染的革兰氏阳性菌，均对万古霉素敏感。但随着万古霉素广泛使用，以及临床用药中的不合理现象，导致了耐药问题逐渐发生并有流行的可能，使得开发万古霉素替代品迫在眉睫。雷莫拉宁（Ramoplanin，A-16686，MDL62）便是其中最有开发价值的品种之一，1984年，意大利Bruno等人在游动放线菌（Actinoplanes sp.)中首次分离得到了一种新型抗生素——抗革兰氏阳性菌的糖肽类抗生素雷莫拉宁。1989年完成结构确认，后由意大利Biosearch、Genome Therapeutics等公司进行商业化开发。由于雷莫拉宁攻击细菌的方式让细菌无法轻易产生抵抗性，因此产生抗药菌株的可能性较低，其前景被国外药学专家十分看好。

雷莫拉宁是由A1、A2、A3、A1＇、A2＇、A3＇、Ramoplanose 7个组份组成的抗生素混合物, 由环多肽、配糖和脂肪酸链组成，其中，A2组份为雷莫拉宁的主组份，约占75%以上。雷莫拉宁7个组份均具有1个相同的母核,为17个氨基酸构成的环多肽，根据配糖为三糖、双糖还是单糖以及脂肪酸链的不同，构成雷莫拉宁7个组份。雷莫拉宁的空间结构是由2个反向平行的β₂链构成，其分子内部的2～7 和10～14 位氨基酸残基分别各形成1个β₂链，2个反向平行的链结构由8位的苏氨酸残基和9位的苯丙氨酸残基形成的β2转角连结起来。整个分子的拓扑结构呈U 型,在U型分子的开口处由15～17位的氨基酸残基形成了1个Loop 环结构。雷莫拉宁结构如下图：

 雷莫拉宁抑制细胞壁上肽聚糖的生物合成，其抑菌机制与万古霉素及替考拉宁的抑菌机制不同。万古霉素和替考拉宁对细菌细胞壁的抑制作用主要发生在肽聚糖链的延伸和交联水平上，即作用于肽聚糖生物合成的后期，竞争性结合肽聚糖前体或发生特异性抑制作用，而雷莫拉宁的抑制作用发生在转肽反应之前，是一种膜上反应的抑制物，具有抑制UDP-N-乙酰-D-葡萄糖胺的掺入作用。这种新的作用方式正是人们对雷莫拉宁感兴趣的原因，因为只有抑制同一反应的不同步骤的抗生素,才有可能成为抑制病原菌耐药问题的新型抗生素。

在体内、体外的试验中,雷莫拉宁均表现出良好的广谱抗菌活性,大部分病原菌(革兰氏阳性) 对雷莫拉宁敏感性均高于万古霉素和替考拉宁。另外,雷莫拉宁的细胞毒性要比其它糖肽类抗生素小且无明显不良反应及肾毒性。目前,医院在治疗革兰氏阳性菌(特别是葡萄球菌和肠球菌) 引起的临床感染时可选用的抗生素十分有限,雷莫拉宁因其特殊的抑菌机制及良好的抑菌效果,在用于治疗革兰氏阳性菌引起的感染性疾病中有良好前景。

中国专利CN 101024662A公开了一种雷莫拉宁的纯化方法，将雷莫拉宁粗提物与硅胶混合后，置于硅胶柱上，用甲醇与酸水作为流动相洗脱，由于硅胶为正相填料，长时间使用含水流动相会导致硅胶失活，导致层析分离能力下降，需经常更换硅胶，而且该方法所得产品纯度较低（约85%）。中国专利CN 101838315A公开了一种雷莫拉宁的分离方法，采用大孔离子交换树脂吸附后，用酸性甲醇水解吸，可达到较好的分离效果，但未能对雷莫拉宁各组分比例进行调整与控制。以上两个专利中均在发酵液中调节pH，由于雷莫拉宁在酸性环境中溶解度很大，会造成有效成分丢失在滤液中。

发明内容

本发明的目的在于克服上述方法不足之处，得到高纯度的雷莫拉宁制备工艺。本发明在发酵液过滤前加入助滤剂，有效净化了菌丝体，在浸提过程调节pH，防止了发酵液直接调pH造成的有效成分丢失，根据雷莫拉宁化学结构中羟基多的特点，采用聚酰胺分离纯化雷莫拉宁，实现了雷莫拉宁各组分与杂质的高效分离，可得到高含量的雷莫拉宁精粉，纯度大于95.0%，总收率大于85%。本发明工艺简便，适于工业化规模生产高纯度雷莫拉宁。

在本发明方法中，在雷莫拉宁发酵液中加入助滤剂，过滤得菌丝体，用酸性极性溶剂浸提菌丝体，浓缩浸提液，过滤得粗提物，粗提物用极性溶剂与水的混合液稀释后，用聚酰胺柱吸附，再用极性溶剂与水的混合液洗脱，浓缩、过滤、干燥，得到高纯度雷莫拉宁精粉。