[发明专利]蓝色刺孢霉菌株发酵培养基的优化

说明书

【技术领域】

本发明涉及诱变选育的蓝色刺孢霉的发酵培养基，属于生物工程和酶制剂制备技术领域。 

【背景技术】

蓝色刺孢霉是我们从红曲米中分离纯化出的一株产凝乳酶的菌株。但是这株菌的凝乳酶活力不高，我们以蓝色刺孢霉为出发菌株，应用紫外线和硫酸二乙酯复合因子诱变出发菌株。诱变选育的优良菌种DU10(其微生物保藏号是：CGMCC 5423)，以葡萄糖马铃薯培养基为发酵培养基，发酵液凝乳酶酶活在110SU/mL左右波动，所产酶活不够理想。因此，仍需对DU10的发酵培养基进行优化。 

微生物的生长、代谢、传代都是非常复杂的生化过程，在这些过程中，需要大量的营养物质作为底物或诱导物，同时也有一些物质会对微生物的生长代谢产生抑制，即使是同一种物质也有可能出现随着浓度的变化而改变对产酶情况影响的现象。培养基的设计可从碳源、氮源、无机盐、生长因子和前体等方面考虑，并对其浓度进行优化。 

【发明内容】

本发明的目的是提供一种诱变选育后蓝色刺孢霉优良菌株培养基优化的方法，提高蓝色刺孢霉发酵液凝乳酶活。主要工艺路线：利用诱变后的蓝色刺孢霉优良菌株DU10(其微生物保藏号是：CGMCC 5423)，通过改变培养基配方提高凝乳酶发酵液酶活。 

本技术方案如下： 

1)无菌操作注入10mL无菌水到保存的DU10PDA斜面中，洗下斜面上的孢子，然后振荡使孢子分散，G3玻璃漏斗过滤，血球板计数并调整孢子浓度为10⁷～10⁸个/mL。 

2)在发酵基础培养基中，分别替换其中的碳源、氮源，研究碳、氮源及其浓度对发酵液品质的影响。培养条件为：接种由斜面制备的10⁷～10⁸个/mL孢子悬浮液，接种量1％，30℃，150r/min，振荡培养96h。测定发酵液的凝乳酶酶活(MCA)和蛋白水解活性(PA)，发酵液凝乳酶活越高，MCA/PA比值越大，则发酵所产凝乳酶越好。 

3)选择步骤2)确定的合适碳、氮源及其浓度；添加不同金属离子和表面乳化剂，考 察它们对发酵产酶品质的影响，确定优化培养基所添加的金属离子与表面乳化剂的种类及浓度。培养条件和要求同步骤2)。 

4)最优培养基配方的验证 

发酵罐验证：根据实验所得的最优培养基，配制4L发酵培养基装入10L发酵罐，培养条件同步骤2)，测发酵液凝乳酶酶活。 

上述步骤2)中发酵基础培养基的配方如下，均为百分含量： 

葡萄糖2％，蛋白胨0.4％，酵母膏0.1％，蒸馏水补足1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。 

上述试剂和培养基配方，如无特别说明，均为本领域常规试剂和培养基。 

上述步骤2)中凝乳酶活力的测定方法为：用0.01mol/L的CaCl₂配制100g/L的脱脂乳，放置40min使所形成的牛乳体系趋于稳定，然后取5mL脱脂乳于试管中36℃保温5min。发酵液5000r/min离心10min使菌丝沉淀，取其上清液0.5mL加入保温的脱脂乳中，漩涡混合器上迅速混合均匀并开始计时，当试管壁上有凝结小块，准确记录发酵上清液使牛乳凝固的时间。定义40min凝固100g/L的脱脂乳1mL所需的凝乳酶量为一个索氏单位(Soxhelt unit，SU)。 

凝乳酶活公式为：SU=2400×5×DT×0.5]]>

式中：T-凝乳时间/s；D-稀释倍数。 

上述步骤2)蛋白水解活性的测定采用Folin试剂法，用10mL0.1NNaOH溶解酪蛋白，pH6.2磷缓冲液定容至100mL。发酵液36℃保温，660nm处比色测酶活力。定义36℃、pH6.2每1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个蛋白酶活力单位(U)。 

蛋白水解活性公式为： 

式中：A-蛋白酶活测定时OD值在标准曲线上对应的酪氨酸含量μg/mL。