[发明专利]一种高产抗真菌物质Iturin A的RNA聚合酶突变体的制备与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种高产抗真菌物质Iturin A的鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株的RNA聚合酶突变体的筛选及其应用。 

背景技术

随着人们对生活质量要求的提高以及环境生态面临的种种危机，农业生产面临的最大挑战就是如何在未来能够找到环境友好型的化学农药的替代品来抵抗农业病害，随着各国科学家的研究发现，源于有益微生物的生物农药是最有希望成为这类产品的替代品(Marc Ongena等，Cell，2007，16(3)：115-125)。一方面微生物是地球上最庞大的生物类群，它不仅具有广泛的生物多样性，而且还可通过菌种选育、代谢调控、规模发酵以及其它现代生物工程技术大幅度提高目标物质的产量，易于实现工业化生产；另一方面，微生物杀菌剂(活的微生物及其代谢产物)较化学农药更加安全，易降解，合成成本较低。其中基于Bacillus subtilis QST713和QST2808菌株的生物农药已由美国Agraquest公司生产，商品名为SerenadeTM和Sonata AS(Cao CX等，Agric.Nat.Resour，2010，SAG-18-10)。 

然而，由于微生物农药中活性成分含量较低，严重制约了微生物农药的生产和推广。目前用于提高微生物农药中活性物质的方法主要有： 优化培养基组成及发酵条件(Zmijewski M J等，J Antibiot，1986，39(10)：1483)； 前体控制及产物的衍生化处理(Boeck L D等，J Antibiot，1990，43(6)：607)； 优良菌种的筛选及诱变育种(李晶等，安徽农业科学，2008，36(1)：106-111，132)。 

本发明核心突变体来源于鲍曼氏不动杆菌LCH0606(Acinetobacter baumannii LCH0606；菌种保藏号：CGMCC No.1752)及其生防菌专利产品(专利授权号：ZL200610088339.7)，该生防菌剂的抗真菌机理是能够合成广谱抗真菌物质Iturin A，其对大豆炭疽病、辣椒疫霉病、番茄灰霉病、小麦赤霉病及水稻纹枯病等病害有显著的防治效果，特别对药用植物地黄连作障碍有很好的控制作用。为此，本发明以此生防菌为基础，通过RNA聚合酶自然突变技术，获得了高产Iturin A的RNA聚合酶突变体，为Iturin A的产业化生产提供了一条新的途径和生产菌株。 

发明内容

本发明主要目的是：提供一种利用RNA聚合酶突变技术提高Iturin A的技术，获得的Iturin A产量提高的鲍曼氏不动杆菌LCH0606的RNA聚合酶突变体，并应用于植物病害和药用植物连作障碍的防治。 

本发明的技术方案： 

1.LCH0606菌株RNA聚合酶突变体的获得 

菌种的活化 

将菌株LCH0606于LB液体培养基中活化，然后接种于8支含LB液体培养基的试管中进一步培养。 

突变菌筛选平板的制取 

将LB固体培养基加热融化后，加入一定浓度的利福平溶液于已融化的培养基中，摇匀后在无菌条件下以20-30ml的量倒于直径为90mm的平板中。 

将 中8支原始菌种种子液，分别以每平板200μL的接种量均匀涂布于8个 法制得的平板上。37℃暗处培养2天后取出，所见菌落即有可能为RNA聚合酶突变体，进而通过对该突变体中rpoB基因的PCR和PCR产物的序列分析，进一步确定突变体的突变基因是否发生在编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因上。 

2.突变体及其生产Iturin A的含量测定 

通过抑制植物病原真菌活性实验和HPLC检验，确定高产突变体的抗真菌活性及所产生的Iturin A的含量。 

3.高产突变体突变基因位点的确定 

利用细菌DNA提取试剂盒，提取个突变体的DNA，并用一系列引物进行PCR扩增，获得完整的rpoB基因序列，经序列分析以及与野生型菌株rpoB序列的同源性比对，找出突变碱基及相应的氨基酸。 

4.突变体及其产生的Iturin A对植物病原真菌的防治实验 

采用皿内实验，测定各突变体发酵液及其无菌滤液抗植物病原真菌生长活性。 

5.突变体在防治地黄连作障碍中的作用 

采用浸种处理方式，研究LCH0606菌株突变体在防治地黄连作障碍中的作用。浸种时间为30分钟。 

本发明与现有技术相比的有益效果：