[发明专利]农杆菌介导的玉米成熟种子胚的转基因方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的玉米成熟种子胚的基因转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建植物基因表达的质粒载体；

(2)构建含有步骤(1)中植物基因表达的质粒载体的根癌农杆菌菌株；

(3)玉米成熟种子的裸露的胚的制备和创伤；

(4)步骤(2)中的农杆菌介导的裸露并且经创伤的玉米成熟种子胚的基因转化；

(5)再生苗的除草剂抗性复筛；

(6)除草剂筛选处理后存活的苗移栽；

(7)玉米转基因植株的聚合酶链式反应(PCR)鉴定。

2.权利要求1的玉米成熟种子的裸露的胚的制备和胚的创伤的应用，其特征在于，具体步骤为：将成熟的玉米种子在无菌双蒸水中浸泡过夜16～20h，将浸泡过夜的玉米种子在无菌操作台上用刀片轻轻划开玉米种皮，再用灭菌缝衣针剥去胚乳，留取胚，将胚再用0.1％的氯化汞灭菌处理8min，双蒸水清洗四遍，最后用灭菌的缝衣针轻轻扎刺胚，对胚进行创伤。

3.权利要求1的农杆菌介导的裸露并且经创伤的米成熟种子胚的基因转化，其特征在于，具体步骤为：将200粒裸露并且创伤的玉米成熟种子的胚转入含100μM的乙酰丁香酮的OD₆₀₀为0.5的农杆菌转化菌液中，再加20ml的MS液体培养基和6μl的50mg/ml的乙酰丁香酮；在28℃，100rpm的摇床上培养18-20h；接着将创伤的玉米成熟种子的胚转移到含MS、30g/L蔗糖、100μM乙酰丁香酮、7g/L琼脂、pH6.0的共培养基上，在28℃黑暗共培养3天，

共培养后，先用双蒸水将胚冲洗一次，再用含抗生素Cef的双蒸水洗一次，接着再用双蒸水洗一次，最后将其转至含MS、0.1mg/L的IAA、250mg/L的抗生素Cef、20ppm的Basta、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH6.0的抑菌及筛选培养基上培养一周，然后先打开瓶盖，让抗性苗28℃下，16h光照培养3天后转至经灭菌的土，在28℃，16h光照培养获得除草剂Basta抗性玉米苗，所有涉及的实施过程均在无菌条件下进行。