[发明专利]一种合成的鸭β-防御素-2基因、含该基因的重组质粒与重组酵母转化子及重组鸭β-防御素-2蛋白的生产方法

权利要求书

1.一种合成的重组鸭β-防御素-2基因，其特征在于参照GenBank中注册的鸭AvBD2基因cDNA基因序列，同时根据酵母密码子偏好性对鸭AvBD2基因成熟肽段核苷酸序列进行改造，然后利用基因合成方法合成，改造后合成的鸭β-防御素-2基因核苷酸序列如下：

GATATGTTTTTGTGTAGAATTGGTTCTTGTCATTTTGGTAGATGTCCAATTCATTTGGTTAGAGTTGGTTCCTGTTTTGGTTTTAGATCTTGTTGTAAGTCTCCATGGGATGTTTAA。

2.一种含有合成的重组鸭β-防御素-2基因的重组质粒，其特征在于，

含有重组鸭β-防御素-2基因的重组质粒的构建过程依次是：

（1）鸭β-防御素-2基因上游引物、下游引物的设置过程：根据合成的鸭β-防御素-2基因核苷酸序列经多重比较后设计而成，上游引物设计在该基因起始端，同时根据表达载体pPICZα-A上的酶切位点，上游引物设计时添加了Xho I酶切位点及Kex2与Ste13蛋白酶裂解位点，在Xho I酶切位点前加有3个保护性碱基TCT；下游引物设计在基因末端，并加上Not I酶切位点，在Not I酶切位点位点前加有4个保护性碱基GCTG，所设置的鸭β-防御素-2基因上游引物、下游引物分别为，

鸭β-防御素-2基因上游引物：

5’-TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGGATATGTTTTTGTGTAG-3’Xho I酶切位点 ，

鸭β-防御素-2基因下游引物：

5’-GCTGGCGGCCGCTTAAACATCCCAT-3’ Not I酶切位点 ，

（2）鸭β-防御素-2基因片段的PCR扩增过程：以合成的鸭β-防御素-2基因为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鸭β-防御素-2上/下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：10×PCR Buffer5μL，4×dNTPs4μL，浓度均为20μmol/L的鸭β-防御素-2上、下游引物各1μL，模板为合成的鸭β-防御素-2基因1μL，ddH2O37.5μL，浓度为5μmol/L的 ExTaq DNA聚合酶0.5μL，10×PCR Buffer包含0.5mmol/L MgCl2、50mmol/L KCl、10mmol/L Tris·HCl、0.001wt%明胶，4×dNTPs包含用量均为2.5mmol/L 的dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP，反应过程依次为：a、94℃处理3min；b、依次94℃处理30s、56℃处理30s、72℃处理30s；反应过程进行30个循环；c、72℃延伸10min；即获得鸭β-防御素-2基因的PCR产物， 

（3）重组质粒pPICZα-A-AvBD2的构建：将过程（2）的鸭β-防御素-2基因的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，加入乙醇获得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE溶解，TE包含有10mmol/L Tris·HCl、1mmol/L EDTA ，TE溶解物用XohI、Not I进行双酶切处理，胶回收大小约130bp的条带；以同样的方法对pPICZα-A质粒进行双酶切处理，胶回收大小为3.6kb的DNA片段，分别取5μL双酶切后胶回收的鸭β-防御素-2基因片段和3μL双酶切后胶回收的pPICZα-A质粒，加入1μL 的10×T4 DNA连接Buffer，1μL T4 DNA连接酶，在16℃下连接处理18小时，将连接产物转化Top 10感受态细胞，在含有25μg/mL Zeocin的低盐LB琼脂培养板中，37℃培养过夜，即完成重组质粒pPICZα-A-AvBD2的构建，形成转化入重组质粒pPICZα-A-AvBD2的Top 10阳性菌，10×T4 DNA连接Buffer包含有 0.5mol/L Tris·HCl、 0.1mol/L MgCl2、 50mmol/L DTT、5mmol/L DATP。