[发明专利]乳腺特异性表达水牛PRL基因载体、构建及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种乳腺特异性表达水牛PRL基因载体、构建及其应用。

背景技术

催乳素(prolactin，PRL)是脑垂体分泌的一种单链多肽类激素，在动物体内具有多种重要的生物学功能，目前已发现的生物学功能超过300种，其中对启动和维持泌乳具有重要意义，对乳蛋白、乳糖和乳脂等重要乳成分的合成起主要调控作用，因而PRL基因是与产奶量密切相关的基因之一。Brym等研究表明，PRL-RsaI位点对奶牛的产奶量和乳脂率具有显著影响。PRL基因缺陷性小鼠中，纯合体雌性小鼠乳腺不发育，切片结果显示，其乳腺腺泡未得到正常发育。假孕兔注射PRL，能引起乳腺腺泡分化，高尔基氏囊泡膨大，腺泡腔内出现大量的脂肪球和蛋白质胶粒。体外实验表明，PRL有促进未分化的乳腺细胞分裂的作用。而乳腺腺泡细胞的发育则需要雌二醇、孕酮与催乳素的协同作用。由此可见，催乳素PRL基因对奶牛泌乳性能具有重要调节作用。

目前，对PRL的有关研究日益增多，开展实验需要大量PRL蛋白，例如Elisa试剂盒需要标准品；生产各类抗体过程中，也需要PRL蛋白作为抗原。然而，由于PRL仅在垂体组织中大量表达，而垂体是一个很小的内分泌腺(例如成人垂体大小约为1x1.5x0.5cm³，重仅约0.5～0.6克)，从垂体中提取纯化的催乳素价格极其昂贵，远不能满足市场需求。通过原核表达方法纯化出的PRL蛋白，由于无法确保其序列空间折叠的正确性，生产的蛋白难以保证具有生理活性。市场上的PRL蛋白主要依靠细胞系表达法生产，可是生产成本依然昂贵。因此，急需发展一种可以大量获得廉价RPL蛋白的方法。

此外，2004年中国人均奶类年占有量仅18.4公斤，在世界上排在百名之后，不及世界平均水平的1/5、亚洲平均水平的1/2。因而，现阶段急需一种可提高动物产奶量的方法，以满足市场对奶制品的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种乳腺特异性表达水牛PRL基因载体、构建及其应用，利用该乳腺特异性表达水牛PRL基因载体可生产转基因动物，用于生产水牛PRL蛋白并能提高转基因动物的产奶量，以满足市场对廉价RPL蛋白和奶制品的大量需求。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：乳腺特异性表达水牛PRL基因载体，该载体是：

载体一pMD18T-BCN-PRL/His-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40polyA，

或载体二pMD18T-BCN-PRL/His-BCNpolyA-EF321-EGFP-IRES-NEO-SV40polyA。

上述乳腺特异性表达水牛PRL基因载体的构建方法，主要包括以下步骤：

<1>提取水牛垂体总mRNA，经反转录后，采用特异性引物进行PCR扩增得到全长水牛PRL的cDNA序列，经胶回收纯化PCR产物后，将其TA克隆插入到pMD18T载体中，得到pMD18T-PRL载体；

<2>以步骤<1>中得到的载体为模板，用加有酶切位点和His标签的引物进行PCR扩增，得到水牛PRL基因的CDS片段，并将其TA克隆到pMD18T载体中，得到pMD18T-PRL/His载体；

<3>以pMD18T为载体骨架，依次酶切连入KpnI-BCNpolyA-SacI、BamHI-PRL/His-KpnI、SalI-NotI-BCN-BamHI、SalI-cmv-EGFP-SV40polyA-NotI或SalI-EF321-EGFP-IRES-NEO-SV40polyA-NotI四个片段，得到载体一或载体二。

步骤<1>引物为：上游引物5’-AGCCTAGGACGAGAGCTTC-3’，下游引物5’-GGGGTACCGATTTTGACATCGCTACAGAGT-3’；

步骤<2>引物为：上游引物5’-CGGGATCCATGCACCATCATCATCATCATCTGGTGCCACGCGGTTCTACCCCCGTCTGTCCCAAT-3’，下游引物5’-GGGGTACCGATTTTGACATCGCTACAGAGT-3’。

上述乳腺特异性表达水牛PRL基因载体在生产转基因动物中的应用。

采用原核注射法，将载体一或载体二转移到小鼠或水牛胚胎中，得到乳腺特异性表达水牛PRL蛋白的转基因小鼠或水牛。