[发明专利]下呼吸道病原菌的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种下呼吸道病原菌多重降落PCR检测试剂盒，包括：10×PCR缓冲液，MgCl₂，dNTP，Taq DNA聚合酶，BSA，肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群阳性对照DNA，肺炎链球菌引物，b型流感嗜血杆菌引物和结核分枝杆菌复合群引物；

所述肺炎链球菌引物序列为：5’- AGTGGTAACTGCGTTAGTCCTA-3’与5’- GTGGCGTTGTGGTCAAGAG -3’；

所述b型流感嗜血杆菌引物序列为：5’- ATGTTAGATCGTGCGGATACTC-3’与5’- GCGAGGAACAGAACCATCAG-3’；

所述结核分枝杆菌复合群引物序列为：5’- GGTAGCAGACCTCACCTATGT-3’与5’- CTCTGGCGTTGAGCGTAGTA-3’。

2.一种下呼吸道病原菌多重降落PCR检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

（一）提取待检样本DNA；

（二）多重降落PCR法扩增检测待检样本DNA中的cpsA、cap基因与IS6110序列，具体步骤如下：

反应体系：25 μl，包括H₂O 11.55 μl，缓冲液（10×PCR）2.5 μl， BSA(10 mg/ml)                0.25 μl，Sp_cpsA-F（10 μmol/L）1 μl，Sp_cpsA-R（10 μmol/L）1 μl，Hib_cap-F（10 μmol/L）          1 μl，Hib_cap-R（10 μmol/L）1 μl，TB_IS6110-F（10 μmol/L）1 μl，TB_IS6110-R（10 μmol/L）        1 μl，MgCl₂(25 mM) 2 μl，dNTP(10 mM) 0.5 μl，Taq DNA聚合酶（5U/μl）0.2 μl，DNA 模板                        2 μl

引物：

肺炎链球菌引物为：

  Sp_cpsA-F：5’- AGTGGTAACTGCGTTAGTCCTA-3’

  Sp_cpsA-R：5’- GTGGCGTTGTGGTCAAGAG -3’

b型流感嗜血杆菌引物为:

  Hib_cap-F：5’- ATGTTAGATCGTGCGGATACTC-3’

  Hib_cap-R：5’- GCGAGGAACAGAACCATCAG-3’

结核分枝杆菌复合群引物为：

  TB_IS6110-F：5’- GGTAGCAGACCTCACCTATGT-3’

  TB_IS6110-R：5’- CTCTGGCGTTGAGCGTAGTA-3’

（三）PCR反应循环参数如下：

94℃ 5min；94 ℃ 30s, 65℃ (每循环降低0.5℃) 30 s, 72℃ 1 min，20个循环；94 ℃ 30s, 55 ℃ 30s,72℃ 1 min,20 个循环；72℃ 7 min

（四）电泳检测鉴定：

对多重降落PCR反应产物进行琼脂糖电泳检测，如电泳图中含有653 bp、177 bp、494 bp条带则分别代表检出肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌复合群。