[发明专利]制备高硒灵芝材料的方法

权利要求书

1. 一种制备高硒灵芝材料的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）将灵芝菌种接入PDA综合培养基中进行试管菌种培养得到初始试管菌种； 

（2）将硒源与PDA综合培养基混合分别配制成梯度硒浓度的含硒培养基，对含硒培养基进行灭菌处理，采用菌悬液接种方式将灵芝菌种接种到灭菌处理后的含硒培养基上按照硒浓度从低到高的顺序按照常用的灵芝菌种培养方式逐一硒浓度进行耐硒培养得到耐硒培养菌种；首次耐硒培养使用的菌悬液为初始试管菌种，以后耐硒培养采用的菌悬液为当前硒浓度进行耐硒培养得到的耐硒培养菌种，依次类推；当灵芝菌种生长出现下列情形之一时：

i）菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；

ii）菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；

iii）菌株明显变色；

且相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值在预定阈值内时，停止耐硒培养，并确定灵芝的最佳耐受硒浓度为前一批次耐硒培养基的硒浓度和高耐硒灵芝菌种；

（3）将步骤（2）中获得的高耐硒灵芝菌种接入经灭菌处理的含硒液体发酵培养基中，所述含硒液体发酵培养基的硒含量为500-1500 mg/L，培养条件为温度为25～33℃，转速为100～200转/分的最优化条件下，进行灵芝液体富硒深层培养即得高硒灵芝材料。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中当灵芝菌种生长出现下列情形之一时：

i）菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；

ii）菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；

iii）菌株明显变色；

当相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值大于预定阈值时，调整耐硒培养基的硒浓度，使耐硒培养基的硒浓度大于前一批次耐硒培养基的硒浓度，且耐硒培养基的硒浓度小于当前批次耐硒培养基的硒浓度，然后以调整硒浓度后的耐硒培养基按照步骤（2）的方法继续进行耐硒培养。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中调整耐硒培养基的硒浓度是根据预定阈值或预定阈值的整数倍数进行调整，当灵芝菌种生长出现下列情形之一时：

i）菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；

ii）菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；

iii）菌株明显变色；

当相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值大于预定阈值时，调整耐硒培养基的硒浓度为当前批次耐硒培养基的硒浓度减去预定阈值或预定阈值的整数倍数后的硒浓度。

4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中调整耐硒培养基的硒浓度是根据相邻批次耐硒培养基的硒浓度进行调整，当灵芝菌种生长出现下列情形之一时：

i）菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；

ii）菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；

iii）菌株明显变色；

当相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值大于预定阈值时，调整耐硒培养基的硒浓度为相邻批次耐硒培养基的硒浓度的平均值。

5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中PDA综合培养基每100ml定容培养基中，所用原料为：马铃薯 20g，葡萄糖 2g，琼脂 1.5g，  MgSO₄·7H₂O 0.15g，KH₂PO₄ 0.3g，VB1 0.001g，pH调至6.0。

6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中所述PDA综合培养基的配制方法包括先将应加入的马铃薯与蒸馏水混匀，保持沸腾30分钟后过滤，加入其他原料并充分混合后定容至所需体积的步骤。

7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中硒源选自亚硒酸钠、硒酸钠或富硒酵母粉。

8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中梯度硒浓度的含硒培养基为硒浓度分别为10、30、50、80、100、120，140、160 mg/L的含硒培养基；当灵芝菌种完成160 mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒灵芝菌种。