[发明专利]水产品中金黄色葡萄球菌的双重PCR-DHPLC检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种金黄色葡萄球菌检测方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一类重要的食源性致病菌，广泛存在于空气、土壤、水以及人和动物的体表黏膜等。据美国CDC报告，金葡菌引起的食物中毒仅次于大肠埃希菌，已居第2位，占细菌性食物中毒的33％，而由金葡菌污染引起的食物中毒事件在我国也是高频多发。显而易见，金葡菌的污染已成为世界性的公共卫生问题。因而，建立特异灵敏、快速便捷的检测技术已成为有效控制食品中金葡菌污染与传播的关键所在。

金葡菌能产生多种毒素，如肠毒素、表皮剥脱毒素、杀白细胞素和毒性休克综合征毒素等，其中肠毒素是引起金葡菌食物中毒的主要原因。该毒素一旦侵入人体，即使无活的金葡菌存在，也会引起人类恶心、呕吐等严重的食物中毒，而且该肠毒素在100℃条件下经过30min热处理仍能保持致病性。金葡菌可产生A、B、C、D、E等多种肠毒素，以A型肠毒素引起的食物中毒事件最多，其毒力也最强。鉴于金葡菌对食品安全的高度危害性，各国对人工养殖及海捕水产品均有严格的限量要求，多规定为不得检出或小于50个/克。然而，该菌超标问题时常困扰着出口水产加工企业，成为制约企业发展和经济效益提高的一大障碍，也使其成为检验检疫部门重点监控的项目之一。

水产品中金葡菌的传统检测方法包括增菌、生化鉴定、血清学鉴定等，不仅检测周期长、操作繁琐，而且不宜做大批量样本的检测，在水产养殖环境监测等其他需大批量检测的方面，传统的检测方法暴露出其种种弊端。随着分子生物学的发展，PCR技术的产生使得食品中金葡菌的快速检测达到了一个新的高度。金葡菌的耐热核酸酶基因已被证实具有非常好的种属特异性，以此作为靶基因进行PCR检测，也可避免检测酶活性时出现的假阳性现象。这类文献可以参考申请号为200910010798.7的中国发明专利申请公开《食品中金黄色葡萄球菌毒素基因的检测试剂盒及检测方法》(公开号为CN101580873A)，也可以参考申请号为200910041301.8的中国发明专利申请公开《金黄色葡萄球菌的多重PCR-MIX快速检测试剂盒及检测方法》(公开号为CN101613745A)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种自动化检测的水产品中金黄色葡萄球菌的双重PCR-DHPLC检测方法，通过该方法还能同时判断菌株致病性强弱。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种水产品中金黄色葡萄球菌的双重PCR-DHPLC检测方法，其特征在于包括如下步骤：

①金黄色葡萄球菌培养，将待测水产样品与增菌液混合，进行培养；

②金葡菌基因组DNA的提取；

③引物的设计：

根据Genbank中金葡菌的sea和nuc基因序列，利用Primer5.0软件设计2对特异性引物，如下：

sea-F：5’-AGTCTGAATTGCAGGGAAC-3’，

sea-R：5’-CACCACCATACATACAAGC-3’；

nuc-F：5’-CTTGCTATGATTGTGGTAGC-3’，

nuc-R：5’-CTAGCAAGTCCCTTTTCCAC-3’；

④以金葡菌基因组DNA为模板，进行双重PCR扩增；

⑤PCR产物的DHPLC检测，得到DHPLC峰型图谱，供分析鉴定。

作为优选，步骤①中所述的金黄色葡萄球菌培养如下：取样品1mL与10mL 10％氯化钠胰酪胨大豆肉汤混合，于36℃±1℃培养18h～24h，其中，待测样品与增菌液之间体积配比为1∶10。

作为优选，步骤①中所述的金葡菌基因组DNA的提取，如下：

取培养后的增菌液1mL，离心，去除上清，得到沉淀用溶葡菌酶进行预处理1h；然后按照细菌DNA提取试剂盒的说明书提取金葡菌基因组DNA。

作为优选，步骤④双重PCR扩增条件如下：

双重PCR反应体系：含20mM Mg²⁺的10×PCR Buffer 5μL，10mM的dNTP 2μL，两对50μM的引物各0.5μL，2u·μL^-1的Ex Taq酶1μL，模板DNA 2μL，最后用ddH₂O将反应总体积补足至50μL；

双重PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性45s，60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

作为优选，步骤⑤中DHPLC检测如下：