[发明专利]一种广谱抗植物病毒的转基因植物的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种广谱抗植物病毒的转基因植物的制备方法。同时还涉及一种广谱抗植物病毒的转基因植物的用途，具体地说，本发明涉及苏云金芽胞杆菌中群体感应信号分子降解蛋白编码基因aiiA通过农杆菌转化烟草，获得广谱抗植物病毒的转基因烟草，对不同种类的重要的植物病毒如烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒等都有较好的抗病毒效果。本发明的技术方法将可广泛应用于经济作物的病毒病防治。

背景技术

自然界中，很多植物都会受到病毒侵染而引起病毒病。植物病毒虽是严格的细胞内寄生物，但专化性并不强，往往一种病毒可寄生在不同种、属甚至不同科的植物上，常常发生复合侵染。几乎每种农作物和经济作物都受到几种甚至十几种病毒的危害而减产或绝产。植物病毒病是一种全球性的病害，每年全世界由植物病毒病造成的农作物损失难以计数。我国是个农业大国，随着生态条件的改变和植物种质资源的引进，病毒种类有逐渐增多，危害逐渐加重的趋势。

病毒在植物细胞内绝对寄生，其复制所需的能量、物质、场所完全由寄主细胞提供，加之植物没有完整的免疫代谢系统，这使得植物病毒病的防治非常困难。对于植物病毒病害的防治大多使用的是综合措施，但这些传统的方法都存在局限性。如对于一些虫传病毒可用农药来杀死传染病毒的昆虫，但这种方法所用化学农药易造成环境污染，而且对病毒感染植物后的病害药效不显著。对于适用于无性繁殖的农作物可以组织脱毒法获得无病毒病的种植材料，但缺点是成本高、工作量大，特别是由于田间的再侵染，维持无毒的有效期不长。近年来植物抗病毒基因工程的诞生为人们防治病毒病带来了希望。

2000年Dong等从一株芽胞杆菌菌株240B 1中克隆到了编码降解群体感应(Quorum sensing)信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones，AHLs)的蛋白基因aiiA。之后用根癌农杆菌法把该基因转化烟草、马铃薯后，增强了马铃薯、烟草对大白菜软腐病菌(Erwinia carotovora SCGl)的抗性。此外还发现AiiA蛋白不仅能提高转基因植物对病原细菌的抗病能力，还可以提高动物的免疫力。但关于该基因在抗植物病毒方面的功能还没有相关报道。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种广谱抗植物病毒的转基因植物的制备方法，方法易行，操作简便，增强对不同植物病毒的广谱抗性，获得的转基因植物可以增强对不同植物病毒的抗性，将可广泛应用于经济作物的病毒病防治。

本发明的另一个目的是在于提供了一种广谱抗植物病毒的转基因植物在烟草中的应用，该发明的主要优点是对重要的植物病毒都有广谱的抗病效果，可以应用于主要作物的转基因抗病毒。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种广谱抗植物病毒的转基因植物的制备方法，其步骤是：

a.转化载体的构建：

将苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，本单位袁志明研究员惠赠，请见遗传资源表)的aiiA基因用限制性内切酶酶切后连接到植物双元转化载体pA8上(购自CAMBIA公司的pCAMBIA 1305.1载体，简称为pA8载体，请见遗传资源表)，通过冻融法将连接好的植物双元转化载体pA8-aiiA转入农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(美国普渡大学S.Gelvin教授惠赠，请见遗传资源表)中。

b.植物遗传转化：

通过叶盘转化方法(参考Horsch et al.，1985)分别转化珊硒烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)和本生烟草(N.benthamiana)，在含有潮霉素的MS培养基(MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA+30mg/L Hygromycin+100mg/LTimentin)上筛选获得转化苗，通过生根培养基(MS+0.1mg/LNAA+30mg/LHygromycin+100mg/L Timentin)获得完整的再生植物，包括转化空载体的pA8再生植物以及转化pA8-aiiA的再生植物。

本发明发现将苏云金芽孢杆菌的aiiA基因通过农杆菌转入烟草中表达，可获得广谱抗植物病毒的转基因烟草。

一种广谱抗植物病毒的转基因植物在烟草中的应用，其应用过程如下：