[发明专利]一种提取梨花粉管细胞核的方法

权利要求书

1.一种提取梨花粉管细胞核的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1)采集花粉：采集大蕾期花药，干燥；

2)花粉培养：分离干燥花药中的花粉，将其加入到花粉培养基中，避光条件下，25～28℃，140～180rpm，培养3～4h；

3)细胞核的释放：将培养好的花粉连同培养基倒入孔径为50μm的细胞筛a内，并使培养基通过细胞筛流出，迅速在细胞筛a底部加一个孔径为40μm的细胞筛b，将两个细胞筛放置于比其直径稍大的培养皿上，迅速将细胞核研磨液加入到细胞筛a中，用玻璃研棒以60～100rpm速度研磨，同时再次添加细胞核研磨液使释放的细胞核不断流出经细胞筛b过滤到培养皿中，以上操作均在4℃下进行；

4)细胞核纯化：将步骤3)所述培养皿中得到的液体加入到离心管中，在漩涡仪上微震动20～40秒，迅速离心(200g，4℃，5min)得上清即为粗细胞核；将上清液转移到Percoll密度梯度工作液顶部离心(3500g，4℃，25min)；离心后，Percoll密度梯度工作液顶部为淡黄色的细胞质，底部沉淀为纯化的细胞核；

5)Percoll的去除：将纯化的细胞核悬浮于细胞核研磨液进行洗涤，并迅速离心(3500g，4℃，25min)；沉淀即为纯化后去除Percoll的梨花粉管细胞核，用研磨液悬浮备用。

2.根据权利要求1所述的提取梨花粉管细胞核的方法，其特征在于所述的花粉培养基配方为：100g/L蔗糖，0.3g/LCa(NO₃)₂·4H₂O，30mM MES，150g/L PEG 4000，0.1g/L硼酸溶于蒸馏水中并定容，用Tris碱调整pH值至5.8～6.5。

3.根据权利要求1所述的提取梨花粉管细胞核的方法，其特征在于所述的细胞核研磨液配方为：0.3M蔗糖，10mM NaCl，10mM MES，5mM EDTA，0.2mM精胺，0.5mM亚精胺，0.2mM PMSF，5mM DTT，0.2％(v/v)Triton-X-100，以NaOH调整pH至6.0。

4.根据权利要求1所述的提取梨花粉管细胞核的方法，其特征在于Percoll密度梯度工作液的配方为：将percoll溶于10mM MES-NaOH(pH6.0)缓冲液中制成28.5％(v/v)的percoll溶液，所述MES-NaOH(pH6.0)缓冲液中包含0.25M蔗糖，10mM NaCl，3mMEDTA，0.2mMPMSF，3mMDTT。