[发明专利]一种体外诱导人羊膜上皮细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法

权利要求书

1.一种体外诱导人羊膜上皮细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤： 

（1）分离hAECs：采用机械法剥离胎盘羊膜组织，用D-Hank’s液反复冲洗，除尽表面血迹，剪碎羊膜后分装于离心管内，加入含有0.02%EDTA 的0.05%胰蛋白酶溶液，消化后弃消化液，再旋转消化，250目不锈钢网过滤，收集单细胞悬液，加含胎牛血清的培养基终止消化，组织碎片用同样方法重复消化2次，合并3次收集的细胞悬液经300目不锈钢网过滤，滤液离心弃上清，再悬浮细胞，离心弃上清，收获细胞即为人羊膜上皮细胞，用低糖-DMEM培养基重新悬浮细胞，以3×10⁸ L^-1细胞密度接种于T₂₅培养瓶，置37℃、饱和湿度、体积分数为5%CO₂培养箱中培养； 

（2）鉴定hAECs：取第2代hAECs波形蛋白和CK19免疫组织化学染色，用流式细胞仪检测CD29、CD73、CD166、CD34和CD45；

（3）诱导hAECs向ISCs分化：诱导分化培养基为含10mmol/L尼克酰胺和N₂补充物无血清高糖-DMEM培养基；取第2代hAECs用诱导分化培养基悬浮，以2.5×10⁶个/ml细胞密度接种于6孔培养板，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%CO₂培养箱中培养7天，第三天用诱导分化培养基换液1次；hAECs经上述诱导分化培养其诱导培养7天即分化为ISCs；

（4）ISCs的鉴定：hAECs诱导培养7天后，①取培养物上清液，采用放射免疫法检测胰岛素含量；② 收集部分细胞，采用逆转录-聚合酶链反应（PT-PCR）检测胰岛素基因mRNA和调节胰腺发育及胰岛B细胞分化的关键性转录因子胰十二指肠同源异型盒因子-1基因mRNA的表达。