[发明专利]一种制备重组人胰岛素原的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种制备重组人胰岛素原的方法，特别涉及了一种利用扩张床吸附技术制备重组人胰岛素原的方法。

背景技术

全球糖尿病人的数量正逐年增长，预计到2025年将达到3亿，而胰岛素是至今仍广泛使用的治疗糖尿病的特效药物，因此胰岛素的消耗量也会随着递增。胰岛素的临床用药量大，每个糖尿病患者每天需使用胰岛素约1.5～2.0毫克，且终身用药，因此开发一种用于大规模低成本制备胰岛素的工艺方法具有良好的商业价值和社会意义。随着生物技术的迅猛发展，基因工程重组人胰岛素面世，较动物来源胰岛素优势更加明显，与人体内胰岛素的序列完全一致，且纯度更高，含宿主蛋白少，安全无毒副作用。现在临床上所用的重组人胰岛素主要为大肠杆菌系统和酵母系统所表达。大肠杆菌系统生产胰岛素最初由Genetech公司和Lilly公司于1982年合作完成，现在多用融合蛋白使其形成包涵体，包涵体溶解后折叠成胰岛素原，经酶处理后形成胰岛素。酵母系统生产胰岛素在1986年研究成功，在酵母中分泌表达的胰岛素原可进一步加工生产胰岛素。因此无论是用大肠杆菌系统还是酵母表达系统，都要先表达生产胰岛素原，再进一步加工成人胰岛素。提供一种制备重组人胰岛素原的简单工艺方法是大规模生产重组人胰岛素的关键。

无论大肠杆菌包涵体复性液还是酵母表达培养液的过滤上清都存在着这样的特点：含有的重组人胰岛素原的浓度低；含有大量色素以及杂蛋白；料液体积大，需要后续浓缩处理，因此对工艺要求较高。中国发明专利CN101029077B公开了一种基因重组人胰岛素原纯化方法，其技术方案为酵母发酵液→加入活性碳→搅拌→离心→上清液→活性碳柱→透过液→阳离子柱层析→含基因重组胰岛素原洗脱液。由于毕赤酵母发酵生产重组胰岛素过程中会产生大量色素和一些杂蛋白，色素的存在严重影响下游的分离纯化，该方法采用两次活性碳处理的方法去除色素，再用阳离子柱纯化目的蛋白，然而用于脱色的活性碳易带来生产环境的污染。中国发明专利申请公开说明书CN1290299A公开了一种重组人胰岛素原的制备方法，该技术方案是将料液上样HP-2MG极性甲基丙烯酸酯树脂(每1L树脂8g蛋白质的比例)后，用20mM乙酸缓冲液洗柱，然后用30％丙酮洗脱。蒸发洗脱液以除去丙酮，从而得到重组人胰岛素原，然而使用丙酮来洗脱，需要后续的蒸发步骤来除去丙酮，可能影响产品稳定性。

自从1993年问世以来，扩张床吸附已广泛应用于基因工程产品的研究与开发，扩张床吸附的优势在于可直接将未经澄清带杂质的物料直接上样，免除了离心或超滤的步骤，可一步起到澄清、浓缩和初步纯化的作用。扩张床吸附技术在基因工程相关领域的应用已见报道，中国发明专利申请公开说明书CN1727361A公开了一种重组人干扰素α1b的纯化工艺，该技术方案用于从表达人干扰素α1b的工程菌种提取重组人干扰素α1b，包括细菌破碎、扩张床吸附、亲和层析和凝胶过滤步骤，从而使得生产效率大大提高，同时生产成本大大降低。中国发明专利申请公开说明书CN1800379A公开了一种用扩张床吸附技术及亲和层析技术制备胰激肽释放酶的方法，该技术方案在于首先用扩张床吸附技术直接初纯化猪胰提取液，再用亲和层析技术进一步纯化制得高纯度胰激肽释放酶，从而简化了生产步骤，提高了生产效率，改进了产品品质，适宜于工业化生产。但是扩张床吸附技术是否可用于酵母系统和大肠杆菌系统表达的重组人胰岛素原的纯化，还未见相关的报道。

文献报道的重组人胰岛素原的制备工艺中，普遍存在的问题是生产过程复杂，含重组人胰岛素原的料液需经过至少两步或两步以上的工艺步骤才能获得纯度较高的胰岛素原，工艺步骤多导致的结果就是收率的下降和生产成本的增加。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明人根据胰岛素原的理化性质，经过大量的试验，筛选了更为合适的工艺条件，减少工艺步骤，提高产品收率的同时保证了产品的纯度，提供了一种制备重组人胰岛素原的新方法，该方法主要是利用了扩张床吸附技术一步从含有重组人胰岛素原的料液中捕获并纯化胰岛素原的方法。

本发明中的起始料液为含有重组人胰岛素原的料液，即大肠杆菌表达的包涵体复性液，或酵母表达培养液的过滤上清。

本发明的方法是利用扩张床树脂柱来制备重组人胰岛素原的，包括如下步骤：

a、柱平衡：扩张床树脂柱先用流动相Ⅰ平衡约3～10个柱体积，平衡流速为200～1000cm/h，管路中液体流向为从树脂柱底部向上流动，使柱中树脂扩张到固定床体积的1～5倍；