[发明专利]嗜热内切木聚糖酶基因工程菌的构建及其酶的应用

权利要求书

1.一种嗜热内切木聚糖酶基因工程菌，含有嗜热内切木聚糖酶基因核苷酸序列SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述的嗜热内切木聚糖酶基因工程菌，其特征在于所述嗜热内切木聚糖酶基因来源于热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)。

3.如权利要求1所述的一种嗜热内切木聚糖酶基因工程菌，其特征在于对所述的嗜热内切木聚糖酶基因的核苷酸序列SEQ ID NO：1之上进行突变、改造或修饰。

4.如权利要求1所述的一种嗜热内切木聚糖酶基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的培养

按照DSMZ的配方配置厌氧培养基，按照100体积份的厌氧培养基注入1体积热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的比例，将热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)接种到厌氧培养基中进行培养；

B、基因组DNA的提取

将步骤A培养的热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)用细菌基因组DNA提取试剂盒提取热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的基因组，得到基因组DNA溶液；

C、引物设计及用PCR法钓取嗜热内切木聚糖酶目的基因

引物设计如下：

上游引物：5’CCAGTCCCATGGAGAGCGAAGATTATTATGAAAA 3’，划线部分为Nco I的酶切位点；

下游引物：5’CGACGACTCGAGAAAGTCAATTATTCTGAAAAATGCC 3’，划线部分为Xho I的酶切位点；

以步骤B所得基因组DNA溶液为模板，在上述上游引物和下游引物的参与下进行PCR反应，得到PCR扩增产物，再对扩增产物进行纯化，得到纯化的PCR产物，然后用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，得到嗜热内切木聚糖酶目的基因；

D、构建重组表达载体

以pET28a为载体，对载体用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，然后用连接试剂盒与步骤C所得嗜热内切木聚糖酶目的基因进行连接，得到重组表达载体；

E、将重组表达载体转化到宿主细胞中

将步骤D所得重组表达载体转化到大肠杆菌B L 21感受态细胞中进行培养，得到嗜热内切木聚糖酶基因工程菌。

5.如权利要求1所述的嗜热内切木聚糖酶基因工程菌的构建，其特征在于：所述的PCR反应的反应体系按以下方法配制：DNA聚合酶(Primer star)1μl，DNA聚合酶缓冲液(Primer star buffer)20μl，作为模板的基因组DNA溶液2μl，2.5mM脱氧核苷酸混合物(dNTP)8μl，上下游引物各加40pmol，加超纯水至总体积100μl；所述的PCR反应的反应程序为：94℃预变性3min；然后98℃变性15s，60℃退火10s，72℃延伸90s，再72℃延伸20min，共30个循环；所述的PCR反应的反应程序为：94℃预变性3min；然后98℃变性15s，56℃退火10s，72℃延伸90s，最后再72℃延伸20min，共32个循环。

6.如权利要求1所述的嗜热内切木聚糖酶基因工程菌的构建，其特征在于：步骤C所述的用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切的酶切体系包括：40μl纯化的PCR产物，上游引物和下游引物各2μl，限制性内切酶缓冲液(FD buffer)4.9μl。

7.如权利要求2所述的嗜热内切木聚糖酶基因工程菌的构建，其特征在于：所述的脱氧核苷酸混合物是脱氧腺嘌呤苷酸、脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物，每种核苷酸的浓度均为25nmol/L。