[发明专利]一种快速准确发现、鉴定及制备蛋白质水解物源抗菌肽的方法

权利要求书

1.一种快速准确发现、鉴定及制备蛋白质水解物源抗菌肽的方法，包括如下步骤：

(1)亲和细胞膜固定相的制备

(2)蛋白抗菌水解物的制备

(3)亲和萃取联用高效液相及质谱技术准确快速发现及鉴定抗菌肽

2.根据权利要求1所述亲和细胞膜固定相的制备，其特征在于：

(1)将在固体培养基中活化好的大肠杆菌接入液体培养基中培养至对数期，离心取得菌体，清洗菌体7-10次以去除残留的培养基。

(2)将步骤(1)中得到的菌体，在-30℃左右的冰箱中冻存4-7h，取出置于10-37℃水浴锅中融解，反复冻融5-9次，低速离心取得菌体。

(3)将步骤(2)中得到的菌体，用400-800W的超声波功率进行细胞裂解处理，超声波每次辐射4-10s，间隔4-10s，总时间40-60min，低速离心取得沉淀，此沉淀为大肠杆菌细胞膜。

(4)将步骤(3)中得到的细胞膜，放在离心管中，然后加入活化好了的大孔球形硅胶，在4-10℃下反应结合20-90min后，采用3-5μm的微孔滤膜反复过滤5-10次，去除液体，取得固体，此固体为细胞膜亲和固定相。

3.根据权利要求1所述蛋白抗菌水解物的制备，其特征在于：

(1)以麻疯树仔粕蛋白为例，利用多种蛋白酶进行酶解，控制料液比1∶8～1∶15混合，在50～60℃下调节pH2.0～9.0，水解得到的不同水解度(7％-15％)的水解物后，调回pH到6.8-7.6，90～100℃水浴灭酶10min，然后对得到的不同水解度的水解物(等溶度1-10mg/ml)进行抗菌测试，取的抗菌能力测试最好的组分并在-20℃下保存。

4.根据权利要求1所述亲和萃取联用高效液相及质谱技术准确快速发现及鉴定抗菌肽，其特征在于：

(1)将权利要求2中得到的细胞膜亲和固定相和权利要求3中得到的最好的抗菌水解物组分，置于1-15ml的离心管中，在10-37℃下孵育萃取20-120min，离心取的上清液。沉淀用缓冲液清洗5-10次，合并清洗液和上清液，并命名为流出液。

(2)将权利要求3中得到的最好的抗菌水解物组分和步骤(1)得到的流出液，利用高效液相-质谱技术，检测其指纹图谱，分析差异峰，纯化制备差异峰并进行抗菌能力测试，同时，找出差异峰的肽系列，制备得到的差异峰为蛋白质水解物源抗菌肽。