[发明专利]一种SELDI分析技术在牛酮病诊断中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种可用于诊断牛酮病的模型，为牛酮病的诊断提供了实验基础。

背景技术

SELDI蛋白芯片技术全称为表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)，是近年用来研究蛋白质组学的一项新的技术平台，具有高通量、高效率、高灵敏度等特点，可以快速地分析各种生物样品中蛋白质组的组成，在基础医学研究、临床疾病诊断以及药物研发方面显示出广阔的应用前景及临床意义。

SELDI技术的原理是利用激光脉冲辐射使芯片表面的分析物解析成带电离子，质荷比不同的离子在电场中飞行时间不同，据此绘制出一张强度不等、分子量不同的谱图。SELDI软件能快速处理、分析大量的质谱图信息，将正常人与某种疾病或者疾病不同阶段的图谱进行比较，就能发现和捕获该疾病及不同阶段时的特异性相关蛋白质。

酮病是由于碳水化合物和挥发性脂肪酸代谢障碍，酮体(乙酰乙酸、丙酮和β-羟丁酸)蓄积于血液和组织内所引起的疾病。多发生于缺乏运动的饲喂富含蛋白质和脂肪的高产舍饲奶牛。大多数病例发生于产犊后的头四周内。

病因普遍认为是由于糖以及脂肪代谢障碍，使大量酮体蓄积于体内。同时血糖降低，血脂升高，遂导致一系列病症。多发生在4-9岁间营养良好的高产奶牛，常于分娩1周后发病。主要症状是食欲减退、体况下降、产奶量减少。神经症状表现为先兴奋后抑制。后期多见营养衰竭、消瘦，四肢瘫痪，卧地不起，有时呈半昏睡状态。病牛呼出的气体及乳、尿中均含有酮类气味(似氯仿的芳香味)。若不及时救治，终因长期卧地不起而被淘汰。

本发明利用蛋白质组学中SELDI这一技术及其生物信息学数据分析，建立了一种可用于诊断牛酮病的模型，为牛酮病的诊断提供了实验基础。

发明内容

本发明利用SELDI蛋白芯片技术，检测奶牛酮病组和正常奶牛组的尿液代谢物，利用软件分析奶牛酮病尿液与正常奶牛尿液中的不同蛋白质，发现差异表达的蛋白，用于牛酮病的鉴定。

本发明将奶牛酮病组的尿液和正常奶牛组的尿液分别进行SELDI蛋白芯片检测，得到原始数据，对原始数据采用Ciphergen ProteinChip Software软件的校正处理，得到peak数据。比较两组间样品的差异，将两组之间的峰值做wilcoxon sum rank test统计检验，用计算出的Pvalue判断peak在两组中是否有显著差异。以0.01作为pvalue的阈值，筛选出pvalue小于0.01的差异peak。

将每组比较中pvalue最小的5个peak在两组中的分布用boxplot展示。通过对有显著性差异的化合物数据做PCA分析，将样品的特征量压缩，在低维度空间反映样品之间的关系。用score plot展示PCA分析结果。用cluster软件对差异化合物做Hierarchical cluster分析，通过聚类图展示各样品之间的关系。用决策树的分类方法寻找不同样品组之间的分子标志物，并使用样品内部交叉验证的方法提高得到模型的可靠性和稳定性。从所有样品中，随机选出70％作为训练样本，其余30％作为预测样本。用训练样本的数据计算出决策树模型，并用这个模型对其余的30％个预测样本的分类情况做预测，计算出预测的正确率。经过500次的交叉验证，选出预测准确率最高的模型作为最优模型，并用所有样品测试最终模型的预测准确率。

具体实施方式

1.样品采集

分别采集奶牛酮病组的尿液和正常奶牛组的尿液置于-80℃保存备用。

2.-80℃冰箱中取出尿液样品，置冰盒上融解；

3.10,000rpm，4℃离心5分钟；

4.芯片每孔加入50％的乙腈溶液5uL放入湿盒中清洗5min。洗涤后干燥芯片15min。

5.H50蛋白芯片放入蛋白质工作平台(Bioprocessor)每孔加入100uL洗脱缓冲液(10％乙腈溶液)室温剧摇(250rpm)孵育5min。重复一次。

6.弃去洗脱缓冲液，每孔立即加入100uL尿液样品，封口膜封口，剧摇(250rpm)孵育60min。

7.弃去样品，每孔加入100uL洗脱缓冲液(10％乙腈溶液)室温剧摇(250rpm)孵育5min。重复一次。

8.弃去洗脱缓冲液，每孔加入100uL HPLC级超纯水震摇(250rpm)洗涤5min。

9.弃去水溶液，将芯片从蛋白质工作平台中取出。空气中干燥10-15min。

10.每孔加入1.0uLEAM溶液。空气中干燥。

11.SELDI上分析蛋白芯片。