[发明专利]一种突变的免疫球蛋白-结合蛋白

说明书

本申请是申请日为2003年3月20日，申请号为03806793.5的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及突变体蛋白领域，更具体地涉及一种与亲本分子相比显示出提高的稳定性的突变体蛋白以及涉及一种生产本发明的突变体蛋白的方法。本发明也涉及一种亲和性分离基质，其中本发明的突变蛋白质被用作亲和配体。

背景技术

在生物技术和制药工业中的大量的应用需要广泛关注污染物的严格去除。

这些污染物可以是例如色谱分析方法中固定相或基质吸附的非洗脱分子，诸如非目的的生物分子或微生物，包括例如蛋白质、碳水化合物、脂类、细菌和病毒。通常进行目的产物的第一次洗脱之后从基质去除这些污染物，以便在随后的应用之前再生基质。此类去除通常包括被称为就地清洗(CIP)的方法，其中使用了能够从固定相洗脱污染物的试剂。通常使用的这类试剂为流经所述固定相的碱性溶液。目前最广泛使用的净化和清洁试剂是NaOH，且其浓度可依据污染的程度和本性在0.1直至例如1M的范围内。已知NaOH是一种能实现多途径地减少污染物诸如微生物、蛋白质、脂类和核酸的有效CIP试剂。NaOH的另一个优点是其可以很容易地被去除而不用任何进一步的处理。然而，此方案涉及将基质暴露于超过13的pH值。对于许多含有蛋白亲和配体的亲和层析基质来说，这样的碱性环境是非常粗糙的条件，并且因此由于配体对所涉及的高pH值的不稳定性而导致了基质能力的降低。

因此广泛的研究集中于开发对碱性pH值具有增大的耐受能力的基因工程蛋白质配体。例如，Gulich等(Susanne Gülich，Martin Linhult，Nygren，Mathias Uhlén，Sophia Hober，Journal of Biotechnology 80(2000)，169-178：对碱性条件的稳定性可被工程改造到蛋白配体中)提出通过蛋白质工程来增加结合链球菌白蛋白的结构域(ABD)在碱性环境中的稳定特性。以前，人们表明了天冬酰胺和谷氨酰胺残基在碱性条件下的结构修饰，诸如肽主链的脱酰胺化和裂解是在碱性溶液处理后活性损失的主要原因，且天冬酰胺是两个中最敏感的(Geiger，T.，和S.Clarke.1987.肽中天冬酰胺酰和天冬氨酰残基的脱酰胺化、异构化和外消旋作用。J.Biol.Chem.262：785-794)。已知脱酰胺化速率是高度特异性和构象依赖的(Kosky，A.A.，U.O.Razzaq，M.J.Treuheit，和D.N.Brems.1999.α-螺旋对天冬酰胺残基稳定性的影响：不同螺旋性的肽中的脱酰胺化速率。Protein Sci.8：2519-2523；Kossiakoff，A.A.1988.三级结构是蛋白脱酰胺化的主要决定因素。Science.240：191-194；和Lura，R.，和V.Schirch.1988.肽的构象在天冬酰胺酰残基的脱酰胺化速率和机制中的作用。Biochemistry.27：7671-7677)，且最短的脱酰胺化的半衰期与序列-天冬酰胺-甘氨酸-和-天冬酰胺-丝氨酸相关。相应地，Giilich等人创造了一种ABD的突变体，其中天然ABD的所有四个残基已被亮氨酸(一个残基)，天冬氨酸(两个残基)和赖氨酸(一个残基)所替代。此外，Giilich等人报道了他们的突变体显示出类似于天然蛋白的靶蛋白结合特性，而且含有工程改造的配体的亲和层析柱在重复暴露于碱性条件之后，比利用父本的非工程改造的配体制备的柱显示出较高的结合能力。因此，断定其中的所有四个天冬酰胺残基可被替代而对结构和功能没有任何显著的影响。

因此，Giilich等人针对结合链球菌白蛋白的结构域进行了研究。然而，亲和层析也用于纯化其它分子诸如例如用于药物应用的免疫球蛋白的操作流程中。一类特别有趣的亲和性试剂是能够特异性结合于抗体分子的不可变部分的蛋白质，此类相互作用不依赖于抗体的抗原结合特异性。此类试剂可广泛地用于通过亲和性色谱层析从不同的样品诸如但不限于获自原种的血清或血浆制品或细胞培养物中回收免疫球蛋白。此蛋白的一个实例为含有能够结合于来自不同种的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分的结构域的葡萄球菌蛋白A。